第07章 临床专用自动生化分析仪分析技术

第七章

临床专用自动生化分析仪分析技术广州医学院医学检验系刘忠民全国高等医药院校医学检验专业规划教材临床生物化学检验（第二版）1教学目标与要求掌握：浊度、电解质、血气和电泳自动分析仪分析技术的基本原理和方法。熟悉：浊度、电解质、血气和电泳自动分析仪的结构组成特点，仪器的维护保养，质量控制和临床应用。了解：浊度、电解质、血气和电泳自动分析仪的分类。2目录浊度自动化分析技术1电解质自动化分析技术2血气自动化分析技术3电泳自动化分析技术4小结与展望5返回总目录3第一节

浊度自动化分析技术4前言浊度分析通过检测溶液浊度,对物质含量进行分析的方法。临床上多用于特定蛋白的分析。特定蛋白在机体内具有某种生理功能，疾病状态时又有着特定的病理生理意义的蛋白质，临床上常被称为特定蛋白（specialprotein）。5一、浊度分析的基本原理和方法6（一）浊度分析的基础理论1.胶体溶液粒子对光具有反射、折射、散射和吸收等作用。2.光透射理论朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律：3.光散射理论雷莱（Rayleigh）公式：7该公式来自气溶胶悬浮微粒，用于溶液时需进行校正。当使用高强度光源（如激光）时，液相悬浮颗粒与非偏振光源的散射作用公式为：公式可见，散射光强度与颗粒的浓度和分子量有关。8雷莱公式与修正公式雷莱公式仅适合直径＜1／10入射光波长的小颗粒Debye修正公式适合于颗粒直径略小于入射光波长的溶液Mie修正公式适合于颗粒直径等于或大于入射光波长的溶液94.免疫浊度分析在一定条件下，可溶性抗原与抗体在液相中特异结合，形成有一定大小的抗原-抗体免疫复合物颗粒，使反应液出现浊度；当光线通过介质中的复合物颗粒时，可形成光的吸收、透射、散射和折射；通过测量透射光或散射光信号强弱，从而推算出被测物的量。10（二）浊度分析的基本方法浊度分析方法的分类根据检测器的位置及其接收光信号的性质分：透射免疫浊度法（turbidimetryimmunoassay）散射免疫浊度法（nephelometryimmunoassay）根据复合物形成速度和测定方式分：终点浊度法速率浊度法根据浊度形成的原理分：沉淀反应免疫浊度法：灵敏度低胶乳凝集比浊（或粒子强化免疫浊度法）：灵敏度高111.透射免疫浊度法指在光源的光路0o角方向上测量透射光强度，并研究其与被检测溶液微粒浓度关系的方法。2.散射免疫浊度法指在光路的5o～90o角的方向上测量散射光强度，并研究其与被测溶液中微粒浓度关系的方法。12免疫浊度分析法测定光路图131.终点散射浊度法检测反应终点与起始点之间信号变化的方法为终点测定法。2.速率散射浊度法所谓速率即指在抗原抗体结合反应过程中，单位时间内两者结合成复合物的量。速率散射浊度法是在抗原与抗体反应的最高峰测定其复合物形成的量，该峰值的高低与抗原的量成正比。14粒子强化免疫浊度法为一种带载体的免疫浊度法，其敏感度较高。该方法选择一种大小适中、均匀一致的胶乳颗粒，吸附或交联抗体；当遇到相应抗原时，则发生聚集。单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过。当两个或更多胶乳颗粒凝聚时，透过光减少，光减少的程度与胶乳凝集量成正比。15二、浊度分析仪的分类和基本结构16（一）浊度分析仪分类1.分光光度仪采用终点法作免疫浊度分析的测定仪。2.自动生化分析仪目前较流行的大型多通道自动生化分析仪多专门编有或可自编透射浊度分析程序。3.散射浊度分析仪应用较为普遍的有固定时间散射分析仪、速率散射分析仪和双光路自动免疫浊度分析仪。17（二）自动散射浊度分析仪的结构主要由分析系统、计算机系统组成。分析系统用于加样、稀释、保温和测试等；包括散射测浊仪、加液系统、试剂转盘、样品转盘、卡片阅读器以及软盘驱动器等；计算机系统用于输入病人数据、选择程序菜单、计算参考曲线和储存测试结果；包括计算机主机、CRT显示屏和键盘等。18散射浊度分析仪光路示意图19三、浊度分析仪的保养20常规保养1.日保养①关机前冲洗管道，以防止管道阻塞。②开机前应检查注射器，防止漏液。③检查稀释液、缓冲液及抗体试剂中液体的体积。④检查废液桶中的废液是否已经装满。⑤在做标本之前必须对所有光路进行光路校正。2.周保养①更换流动比色杯和小磁棒。②用纱布蘸10%漂白溶液清洁探针的外部。③检查蠕动泵和钳制阀控制着管路中液体的流动情况。21常规保养3.月保养①更换注射器插杆顶端；②空气过滤网冲洗；③疏通标本和抗体探针的内部。4.半年保养①更换钳制阀上管道和泵周管道；②给机械传动部分的螺丝上润滑油。22四、浊度分析的质量控制23（一）抗原过剩校正免疫浊度分析的基本要求：始终保持反应体系中抗体适量过剩。抗原过剩的检测方法：①连续监测抗原抗体反应曲线，当抗原过剩时，反应曲线呈现异常。②反应体系中追加抗体，如果浊度继续增大则提示抗原过剩。③待测标本用两种稀释度测定，浓度高的样本浊度反而降低则提示抗原过剩。24（二）减少伪浊度伪浊度：在反应体系中，除待测抗原抗体免疫复合物产生的浊度外，其它可引起透射光或散射光发生变化的浊度都称为伪浊度。减少产生伪浊度的方法：1.标本：采用新鲜、合格标本。2.检测体系：保持比色杯和稀释杯清洁。3.试剂：使用合格的抗体试剂。4.增浊剂浓度：严格控制增浊剂的浓度。25（三）选择合适的入射光波长无论是散射比浊还是透射比浊，入射光波长的选择原则：除了抗原抗体免疫复合物外，反应体系中的其他成分对入射光的干扰应为最小，因为如果反应体系中其他成分吸收了部分入射光，透射比浊法测定结果将使抗原浓度偏高，而散射比浊法测定将使抗原浓度偏低。26（四）仪器校正1.选择合适的校准品2.校准曲线的绘制校准曲线的形状取决于抗血清和促聚剂的浓度的选择，也与所用免疫浊度法类型、校正方法及校准品的质量有关。多推荐5点或6点定标。选择适当的数学方法进行曲线拟合。27五、特定蛋白浊度分析的

临床应用28特定蛋白临床常规项目29免疫功能监测项目免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）、补体（C3、C4）临床意义IgG、IgA、IgM检测有助于了解机体抗感染能力，有助于疾病的正确诊断和有效治疗。在免疫复合物疾病中，C3、C4检测可以了解其消耗程度。适应症①免疫力低，反复感染病人；②自身免疫性疾病；②多发性骨髓瘤；④慢性肝病；⑤非何杰金氏淋巴瘤；⑥白血病；⑦良性单克隆免疫球蛋白病；⑧先天性或获得性低免疫球蛋白血症；⑨对白、球蛋白比例异常者的随访；⑩术后感染、移植排斥反应。返回章目录30第二节

电解质自动化分析技术31前言电解质在溶液中能解离成带电离子而具有导电性能的一类物质。主要指体液中最常测定的Na+、K+、Cl-、Ca2+、Mg2+、HCO3-和无机磷等。电解质分析仪（electrolyteanalyzer）是采用ISE测量溶液中离子浓度的仪器。广泛应用于各级临床实验室，可直接测量患者血液、脑脊液、稀释尿等体液中的电解质离子浓度。32一、电解质分析的原理和方法33（一）离子选择电极电位分析理论离子选择性电极（ionselectiveelectrode，ISE）是一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子具有选择性响应的电化学传感器。在临床实验室，常用于测量离子的活度或浓度。341.ISE基本结构通常由电极管、内电极、电极内充溶液和电极膜（或称敏感膜）四个部分组成。352.电极电位产生大多数电极膜电位的产生是基于膜材料与溶液界面发生的离子交换反应。当电极置于溶液中时，由于离子交换和扩散作用，改变了二相中原有的电荷分布，因而形成双电层，其间产生一定的电位差即膜电位。ISE的电位与溶液中特定离子活度的对数呈线性关系。Nernst方程式：

±：阴离子时为－，阳离子时为＋363.电极电位测量ISE的EISE值不能直接测定必须将ISE与参比电极共同浸入待测样品中组成一个原电池，通过测量E电池来测定EISE值。电池的电动势在一定条件下，原电池的电动势与被测离子活度的对数呈线性关系。37（二）ISE电位分析方法1.定量方法（1）标准比较法（或直读法）指在pH计或离子计上直接读出数值的方法，适用于少量样本的分析。（2）标准曲线法适用于大批量的试样分析。（3）标准加入法当待测溶液组分较复杂，很难控制相同的离子强度时，选用标准加入法。38（二）ISE电位分析方法2.样本测定方式直接法指样本不经稀释直接由电极测量离子活度；优点是可采用全血测定，它迅速方便，结果准确，不会因血清中水体积所占比例改变而影响结果。间接法指样本经一定离子强度缓冲溶液稀释后由电极测量离子活度。与直接法相比，间接法样品用量少；由于样品预先进行稀释，不易堵塞管道；降低了血脂、不溶性蛋白质对电极的污染，以及对电极的损耗，使寿命延长。直接法比间接法测定结果高3％～5％，因为血脂及蛋白质等不包含有K＋、Na＋。39二、电解质分析仪分类和结构40（一）电解质分析仪的分类1.按自动化程度分类分为半自动和全自动电解质分析仪。2.按工作方式分类分为湿式和干式电解质分析仪。3.按仪器的功能分类可分为电解质分析仪、含电解质分析的血气分析仪、含电解质分析的自动生化分析仪等。41（二）电解质分析仪的基本结构湿式电解质分析仪一般由离子选择性电极组、液路系统、电路系统、程序控制模块和显示操作系统等组成42湿式电解质分析仪结构框图431.离子选择性电极组电极组包括指示电极和参比电极。ISE的构成通常采用流动式毛细管结构，即在毛细管的侧臂开多个小孔，孔里插入各种离子选择性电极。在真空泵的负压作用下，待测样被吸入毛细管中，与各个插入电极接触，并将溶液浓度的变化转换成电极电位的变化。一次进样可完成多个参数的测量。44电极结构示意图45钠、钾、氯电极钠电极是一种含铅硅酸钠的玻璃膜电极；钾电极为由缬氨霉素和聚氯乙烯（PVC）等组成的膜电极；氯电极由一个银／氯化银电极组成。462.液路系统通常由标本盘、溶液瓶、驱动电机、采样针、电极系统、蠕动泵、三通阀、管道等组成。主要用于将检测样品、定标液和缓冲稀释液等按工作要求吸取和输送至电极管道中，并完成冲洗电极管道、排除废液的工作。473.电路系统一般由微处理器模块、信号放大及数据采集模块、蠕动泵和三通阀控制模块、输入输出模块、电源电路模块等五大模块组成。共同完成对仪器各部件的动作进行控制，并对前置放大器采集的电极mV值进行处理和计算，完成仪器设定的工作程序，并将运算、处理后结果送显示单元显示或打印输出。484.程序控制系统主要包括仪器微处理系统程序、仪器设定程序、仪器测定程序和自动清洗程序等。5.显示操作系统轻触键盘用于控制仪器工作和输入数据。液晶显示器用于显示输出测量结果，仪器操作提示等。在分析检测样品时，操作者可以通过按键操作控制分析检测过程。49三、电解质分析仪的维护和保养50（一）日常维护l.每日维护检查试剂量，如不足1／4液面，应及时更换；清洁仪器表面灰尘及吸样探针，保持探针的畅通；及时弃去废液瓶中的废液。2.每周维护清洗仪器流路，除去蛋白质、脂类沉积和盐类结晶。513.每月维护用酒精棉球清洁泵管和不锈钢转轴，在泵管的弯处涂硅油或白色凡士林等润滑剂。4.每季度进行MV值试验电极的MV值由仪器使用说明书给出。52（二）仪器的保养1.电极系统的保养定期更换电极膜和电极内充液。定期进行去蛋白清洗及电极的活化。2.流路系统的保养保证流路中没有蛋白质、脂类沉积和盐类结晶。每天工作结束关机前，都要进行管路的清洗。冲洗完毕，应当对仪器进行重新定标。53四、电解质分析的质量控制54（一）分析前质量控制1.样本的采集与处量①采血用器材必须干燥、清洁，最好选用一次性用品。②减少输液对结果的影响。③采血中应避免溶血。④应尽快送检，不能剧烈振荡，不能长时间被日光照射；不能立即测定时应分离血清，置于4℃冰箱中保存。⑤当血样与空气接触时，可造成血样中的CO2浓度偏低，pH值升高，进而使钙离子浓度降低。552.抗凝剂与药物的影响抗凝剂血样不能使用EDTA、柠檬酸盐或草酸盐等抗凝剂。即使用肝素，其浓度通常也不超过20U/ml血样。药物对测量结果的影响有两方面：药物或它的代谢产物，能引起患者体内被测物的浓度发生改变。如利尿剂促进K+、Na+、Cl-从尿中排出。药物直接对ISE的响应产生影响。如水杨酸盐对Cl-电极响应有干扰，维生素C对K+电极响应有干扰等。563.仪器安装仪器要求安装在干净、平稳的工作台上，尽可能避免潮湿和阳光直射；实验室的供电必须符合要求，必要时需连接稳压电源；周围不得有强的电磁干扰源（如离心机等），并确保仪器外壳接地良好。57（二）分析中质量控制1.定标校正液各厂家的定标校正液基本上都不能互换使用。2.电极保养电极使用一段时间后就需要保养。3.质控品选用质量好、性能稳定和对离子选择性电极响应没有干扰的质控血清，作为实验室内的质控品。584.评价分析性能仪器、试剂、方法等整个检测系统一旦确定之后，必须对整个系统的不精密度、不准确度、病人结果的可报告范围、分析灵敏度、分析干扰和参考范围等分析性能进行评价；并建立严格的质量控制规范（包括选用质控品，设定靶值、标准差，绘制质控图，失控情况处理及原因分析等）；然后才能正式用于检测病人样品。59（三）分析后的质量控制异常结果的分析取舍：如葡萄糖、碳酸氢根过低，同时钾离子过高往往是血样未经分离放置时间过长所致。多项检测结果过低，往往提示样品稀释比例不对、样品中有纤维蛋白凝块或吸样针部分堵塞导致吸样量不足所致。对某些急诊检验项目：如血钾、血钙等遇到特别异常结果时，应及时与临床医生联系，以便对患者进行紧急处置。60五、电解质分析技术的临床应用血钠测定在临床的表现为低钠血症和高钠血症；血钾测定在临床的表现为血清钾增高和血清钾降低；血氯测定在临床的表现也是增高和减低。详细应用情况见第十三章体液与酸碱平衡紊乱。返回章目录61第三节

血气自动化分析技术62前言血气分析仪(bloodgasanalyzer)是应用电化学分析技术和原理，采用电极对血液中的pH值、PCO2和PO2进行测定的临床分析仪器。近年来，血气分析仪又增加了新功能，如电解质，尿素氮、肌酐、葡萄糖、乳酸等代谢物及血氧系统定量测定，现代血气分析仪又称为全自动血气／电解质／代谢物／血氧分析仪。63一、血气分析的原理和方法64（一）血气分析仪的工作原理框图65（二）电极的工作原理电极的工作原理即电化学分析原理。电化学分析(electrochemicalanaIysis)是建立在溶液电化学性质基础上并利用这些性质，通过电极这个变换器，将被测物质的浓度转变成电学参数而进行检测的方法。661.pH电极属玻璃膜电极，由钠或锂玻璃熔融吹制而成。通常需与参比电极构成一个电化学电池，通过测量该电池的电动势E而获得相应溶液的pH。在一定温度下，玻璃电极的电极电位E玻与待测溶液的pH有线性关系：67pH电极与甘汞电极结构图682.PCO2电极属气敏电极，是由pH玻璃电极和银-氯化银电极组装在一起形成的复合电极。由内电极、渗透膜、尼龙网和外缓冲液组成，内电极为pH玻璃电极和银-氯化银参比电极。渗透膜只允许血液样品中CO2分子通过。气体CO2分子在内溶液中酸化后使pH下降，再通过pH电极测定。待测溶液中pH值的变化与lgPCO2有线性关系。69

PCO2电极结构图703.PO2电极是一种气敏电极、极谱电极，属氧化还原电极，它基于电解氧的原理实现对氧的测量。PO2电极由铂丝阴极与银-氯化银阳极组成。铂丝被封闭在玻璃柱中，玻璃柱装在一个有机玻璃套内，套的一端覆盖着O2渗透膜，套内空隙充满PO2电极缓冲液。O2渗透膜为聚丙烯膜或聚四氟乙烯膜或聚乙烯、聚酯。71在0.65V的极化电压下，电极电流的大小取决于铂阴极表面O2量。O2在铂阴极表面发生的反应如下：极限扩散电流的大小决定于渗透到阴极表面氧的多少，后者又取决于膜外的PO2。PO2电极电流与PO2成正比，过0点的一条直线，只需要1点定标（校准）。而其他电极的电压与含量（或对数含量）关系都不过0点，所以需要两点定标，且偏差不能大于5%。72PO2电极结构图73（三）血气分析的基本方法血气分析的基本方法包括直接计算法、标准曲线法和标准加入法。具体内容参见离子选择电极电位分析方法一节。74二、血气分析仪的基本结构75血气分析仪的结构由电极系统、管路系统和电路系统三大部分组成。电极系统基本结构参见本节仪器工作原理部分。76(一)管路系统通常由溶液瓶、气瓶、正压泵、负压泵、电磁阀、转换装置和连接管道等部分组成。1.气路系统主要用来提供PO2和PCO2两种电极定标时所需的两种标准气体。依据配气方式，气路系统可分两种类型：(1)外配气方式，又叫压缩气瓶供气方式。(2)内配气方式，又叫气体混合器供气方式。77(1)外配气方式仪器由两个压缩气瓶提供定标气，一个含有5％CO2和20％O2；另一个含10％CO2，不含O2。(2)内配气方式仪器本身配备有气体混合器，以产生定标气。来自空气压缩机产生的压缩空气和气瓶送来的纯CO2气体由气体混合器进行配比、混合，产生符合要求的定标气体。782.液路系统液路系统具有两种功能：①为pH电极系统提供定标缓冲液；②管道冲洗。该系统一般需要四个溶液瓶，分别盛放缓冲液1、缓冲液2、冲洗液和废液。79

(二)电路系统血气分析仪电路系统将仪器测量信号进行放大和模数转换，对仪器实行有效控制、显示和打印结果，通过键盘输入指令。80试剂包式血气分析仪现在也有试剂包式，每盒可测40～50例，包含电极、定标液、定标气体（类似质控）81三、血气分析仪的保养82

(一)仪器的保养①每天检查大气压力、钢瓶气体压力；检查定标液、冲洗液是否过期，检查气泡室是否有蒸馏水；②每周更换一次内电极液，定期更换电极膜；冲洗管道系统，擦洗分析室；③若电极使用时间过长，电极反应变慢，可用电极活化液对pH、PCO2电极活化，对PO2电极进行轻轻打磨，除去电极表面氧化层。83(二)电极的保养1.pH电极血液中的蛋白质容易黏附在电极表面，必须经常按血液→缓冲液(或生理盐水)→水→空气的顺序进行清洗。若清洗后仍不能正常工作，应更换电极。无论使用与否，pH电极的使用寿命一般都为1～2年。如果pH电极在空气中暴露2h以上，应将其放在缓冲液中浸泡6h～24h才能使用。842.PCO2电极电极要经常用专用清洁剂清洗，如果经清洗、更换缓冲液后仍不能正常工作时，应更换半透膜。多数电极的缓冲液密封在电极内，但有些型号的要更换缓冲液。3.PO2电极PO2电极中干净的内电极端部和四个铂丝点应该明净发亮。每次清洗时，都应该用电极膏对PO2电极进行研磨保养。854.参比电极参比电极套需要定期更换。内电极部分不需要保养。在更换盐桥或电极内的KCl溶液时，除加入室温下饱和的KCl溶液外，还需要加入少许的KCl结晶，使其在37℃恒温条件下也达到饱和。同时防止参比电极存在气泡，否则会严重影响电极的功能。86四、血气分析仪的质量保证87(一)定标定标或校准(calibration)制作或校正pH、PCO2和PO2电极系统工作曲线的过程。1.定标方式两点定标：对于不过0点的直线，需要测量2个标准的检测信号，以确定斜率和截距；一点定标：对于不过0点的直线，通过测量1个标准的检测信号，以确定斜率。定标后，根据标准比较法测定血样含量。882.标准物质pH、PCO2电极为两点定标，PO2电极为1点定标。pH系统：使用7.383和6.840两种标准缓冲液。O2和CO2系统分别用1种、两种混合气体来进行定标。3.定标频率可以手动或自动执行，其频率由所用仪器类型及仪器状态而定。当仪器开机时，必须进行两点定标；仪器连续运转过程中，应多次进行一点标定，或重复进行两点定标，以保证结果的可靠性。现代血气分析仪有自动校正程序。89(二)质量控制1.质控物的使用血气分析的参考试剂按基质不同分为水剂缓冲液、全血、血液基质、血代氟碳化合物4种，使用最多的是水剂缓冲液，该质控物用安瓿封存，具有稳定、使用方便等优点。2.质控要求临床实验室每天应测定质控液，并绘制质控图，检测仪器的运行状态和精密性。主动参加各省市临检中心或卫生部临检中心组织的室间质评活动。90水剂质控物用Na2HPO4、KH2PO4及NaHCO3配成不同的pH缓冲液，再与不同浓度的CO2和O2平衡，加入防腐剂贮存，有高、正常、低3种水平规格。质控物用安瓿装，液体并未充满整支安瓿，液相为水及缓冲物质，气相则由O2、N2、CO2及汽水组成。使用时，需在室温平衡后，再用力振摇2min～3min，使气相与液相重新平衡。91五、血气分析的临床应用血气分析在呼收系统疾病和酸碱平衡紊乱中的应用十分广泛。临床应用详见第十三章体液和酸碱平衡紊乱。返回章目录92第四节

电泳自动化分析技术93前言电泳(electrophoresis)带电粒子在电场中的移动现象。电泳技术利用这种现象对化学或生物化学组分进行分离分析的技术。已广泛用于各种生物分子分离分析。94一、电泳技术的基本原理95(一)电泳的基本原理1.荷电性与移动方向机体中的许多生物分子都是两性物质，其荷电性质受介质pH的影响。当pH在生物分子等电点（isoelectricpoint,pI）以下时，带正电荷，否则带负电荷。物质带电性质不同，在电场强度中移动的方向不同。在某个设定的电场中，带电粒子在支持介质中可向与其所带电荷相反的电极方向移动。962.移动的速度与迁移率粒子恒定移动速度

v=QE／6πrη迁移率（μ）指单位电场强度下带电粒子的运动速度，它与带电粒子关系为：粒子带净电荷量愈多、直径愈小、愈接近球形，在电场中移动速度愈快。97(二)影响电泳的因素1.待分离物质的性质一般来说，粒子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。2.缓冲液的性质（1）溶液的pH值：决定了待分离生物分子的解离程度，影响其带电性质、净电荷量。（2）缓冲液离子强度一般在0.02～0.20mol／kg之间。983.电场强度电场强度也称电位梯度，它是指单位长度的电位降（V/cm）。电压越高，电场强度越大，迁移率越大，带电粒子移动越快。4.支持介质的性质包括支持介质的黏性吸附对泳动的阻碍作用，支持介质的分子筛和电渗作用。此外，温度升高时，介质黏度下降，分子运动加剧，引起自由扩散加快、区带变宽和分辨率下降。99二、电泳仪的分类和基本结构100（一）电泳技术的分