龙血竭、苦参、蜘蛛香的体外抑菌活性研究

龙血竭、苦参、蜘蛛香的体外抑菌活性研究

近年来，由于抗生素的不适当使用，临床服药细菌和细菌的数量不断增加，细菌和真菌的耐药性增强，临床感染死亡率不断增加。据报道,龙血竭提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、真菌有抑制作用,但是龙血竭药材的抑菌作用未见报道;苦参碱和氧化苦参碱对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、绿脓杆菌、白念珠菌等多种细菌及真菌有抑菌活性,但是它们的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)较高,抑菌活性不高,对苦参的醇提物的抑菌作用的研究还未见报道;蜘蛛香的抑菌试验研究还未见报道。本实验选取了4种常用指示菌,金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis,B.subtilis)、大肠埃希菌(Escherichiacol,E.coli)和白念珠菌(Candidaalbicans,C.albicans),采用固体培养基连续稀释法,观察龙血竭、苦参、蜘蛛香3种中药的体外抑菌作用。1材料和方法1.1仪器、试剂与仪器303A-4型恒温培养箱(武汉精华科教仪器有限公司),SW-CJ-1F型超净工作台(苏净集团安泰公司),YXQ-SG46-280SA型压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂),202AV-2型干燥箱(武汉精华科教仪器有限公司),DFT-2000型手提式高速中药粉碎机(温州市大德中医机械有限公司),超临界流体萃取仪(北京化工集团)。营养琼脂培养基、沙保氏培养基(上海盛思生化科技有限公司),二甲基亚砜(DMSO,天津科密欧化学试剂有限公司),龙血竭(西双版纳版纳药业有限责任公司);金黄色葡萄球菌ATCC25112、大肠埃希菌ATCC25922、白念珠菌ATCC10231购自中国食品药品检定研究院,枯草芽胞杆菌由贵阳医学院微生物教研室分离鉴定。1.2方法1.2.1提取液制备将龙血竭粉碎过100目筛,称取5g用60%DMSO溶解并定容至50mL;粉碎苦参,用60%乙醇回流提取,微波真空干燥,称取浸膏粉5g用60%DMSO溶解并定容至50mL;粉碎蜘蛛香,超临界萃取(萃取压力12MPa,萃取温度45℃,分离温度35℃,萃取时间1h),称取萃取物5g用60%DMSO溶解并定容至50mL,此时药物的浓度为100g/L。1.2.2阴性对照和营养培养基培养无菌操作下用生理盐水按照二倍稀释法将药物稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625g/L的浓度梯度,同法稀释60%的DMSO空白溶剂做阴性对照。取7个直径60mm的无菌平皿编号后按顺序分别加入配好的药物0.5mL,同法处理阴性对照。营养琼脂培养基经121℃灭菌20min,稍微放冷至60℃左右,用无菌刻度吸管取4.5mL到一份加好药的平皿中,轻摇使药液和琼脂充分混匀,放置,冷却,该含药平皿将接种金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌这3种菌,先做好标记。另外将沙保氏培养基经115℃灭菌20min,然后按照上述方法制备含药培养基,用以接种白念珠菌。1.2.3白三菌种培养采用直接菌落法制备菌悬液。无菌操作下将金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠埃希菌分别划线接种于营养琼脂斜面培养基上,将白念珠菌划线接种于沙氏斜面培养基上,37℃培养24h。将用接种环挑取适量的各菌培养物于无菌生理盐水中,校正菌液浓度相当于0.5麦氏标准比浊管,用无菌生理盐水稀释100倍备用,此时菌液为1.5×106CFU/mL。1.2.4最低抑菌浓度测定无菌操作下用接种环取配制好的菌悬液一环,分别接种于含药培养基及对照培养基表面。将平皿倒置放入37℃培养箱中培养24h,观察细菌在不同浓度药物平皿上的生长情况,无菌生长的平皿所含药物最低浓度即为该药的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)。1.2.5最小杀菌浓度测定将MIC测定中未生长细菌的琼脂用镊子小心取下,反过来涂于营养琼脂平板上,做好标记,37℃培养24h,以仍无细菌生长的管内的药物浓度为该药的最小杀菌浓度(minimumbactericidalconcentration,MBC)。2结果2.1mic测试结果根据1.2.4项下方法测定MIC,结果见表1。表中的药物浓度为每个平皿中药物与培养基混合后的有效浓度。2.2综合测量的结果根据1.2.5项下方法测定MBC,结果见表2。表中的药物浓度为每个平皿中药物与培养基混合后的有效浓度。3苦参碱的抗菌活性物质本实验采用固体连续稀释法中的平板法测抑菌活性,该方法可用于测定同一药物对多种实验菌株的MIC,结果准确,重复性好,且不受药物颜色及浑浊度的影响,特别适合中药的药效学实验。本实验检测到苦参提取物对金黄色葡萄球菌的MIC值(0.3215g/L)比文献报道的苦参碱对金黄色葡萄球菌的MIC值(25g/L)和氧化苦参碱的MIC值(25g/L)要小;对白色念珠菌的MIC值(10g/L)比文献报道的也小很多,说明苦参中的抗菌活性物质并非仅是苦参碱和氧化苦参碱。在临床上,龙血竭片口服联合局部上药治疗宫颈糜烂效果显著且无刺激性,患者依从性好,在治疗带状疱疹、压疮及鼻出血等疾病有很好的疗效;苦参在治疗妇科炎症、炎性外痔、前列腺炎等炎症具有很好的疗效;蜘蛛香对革兰阳性细菌及轮状、非轮状病毒肠炎都具较好的疗效。本实验的体