结直肠癌中淋巴管的分布特点及增殖状态分析

结直肠癌中淋巴管的分布特点及增殖状态分析

尤其是癌症早期，它主要通过淋巴管局部淋巴结转移。然而长期以来,由于缺乏淋巴管特异性标记物,对肿瘤淋巴管生成及其与肿瘤播散转移的研究一直较为薄弱。肿瘤内是否存在新生淋巴管仍有争议。结直肠癌局部淋巴结转移十分常见,但就其淋巴管生成与转移的关系目前仍不清楚。为此,我们拟采用新近发现的淋巴管特异性标记物podoplanin和血管标记物CD34对结直肠癌淋巴管和血管染色,并分别与Ki-67进行双标染色检测其内皮细胞增殖活性,探讨结直肠癌中淋巴管和血管的分布特点、增殖状态及其与转移和预后的关系。材料和方法1.病例选择及随访结果选择第三军医大学大坪医院1996年6月—1998年3月手术切除的结直肠癌及其相应正常结直肠组织各96例,患者中男性50例,女性46例,男女比例为1.09∶1;年龄22~83岁,平均年龄53岁,中位年龄57岁。右半结肠29例,左半结肠67例。高分化腺癌54例,中分化腺癌30例,低分化腺癌12例。Dukes分期:A期25例,B期25例,C期32例,D期14例;伴有淋巴结转移者41例(占42.7%);伴有远处转移者14例(占16.6%)。所有病例均获得随访结果,随访时间3~83个月,平均33.5个月。所有标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,连续切片,厚度3~5μm,行HE染色和免疫组织化学染色。2.单标染色与微波抗体的制备采用SP法和双标法,一抗分别为淋巴管内皮特异性标志物podoplanin(1∶200)、血管内皮标志物CD34和Ki-67(即用工作液)单克隆抗体分别系AngioBio公司、Zymed和Maxin公司产品。HistostainTM-plus和HistostainTM-DS试剂盒系Zymed公司产品,染色方法及步骤参照说明书进行。单标染色采用DAB显色。双标免疫组织化学分别行Ki-67与podoplanin,Ki-67与CD34,podoplanin与CD34染色,前者采用BCIP/NBT显色,后者采用AEC显色。所有染色均进行微波抗原修复。每批染色采用已知阳性的结直肠癌切片作阳性对照,并设立替代实验和阴性对照。3.结说密度和密度的双标染色podoplanin和CD34染色阳性表达于脉管,以阳性着色的单个内皮细胞或内皮细胞簇计为一个阳性微淋巴管和微血管。参照Ohno等和Weidner报道方法进行微淋巴管密度(microlymphaticdensity,MLD)和微血管密度(MVD)计数,在低倍镜下先选取结直肠癌组织肿瘤边缘(肿瘤浸润边缘区)、肿瘤浅表(管腔面区)和肿瘤中心区,以及正常结直肠组织阳性染色脉管最丰富区(hotspot),分别在200×(0.74mm2)和400×(0.16mm2)视野下分别计数MLD和MVD,每例计数3个视野,并求其均值。随机挑选20例结直肠癌及正常结直肠组织进行podoplanin和CD34双标染色显示淋巴管呈蓝紫色,血管呈鲜红色,观察同组织内淋巴管与血管的染色特点及分布情况。Ki-67和podoplanin,Ki-67和CD34双标免疫组织化学染色判定,淋巴管和血管内皮细胞胞质和胞膜呈鲜红色,具有增殖活性的内皮细胞胞核呈蓝紫色。参考Wulff等和Yoon等报道方法,分别计数淋巴管内皮和血管内皮Ki-67标记指数(LI)。4.性、相关性检验采用SPSS10.0软件对数据进行单因素方差分析及显著性、相关性检验。组间计量资料比较采用t检验,相关性采用Pearman相关分析;患者的生存率曲线采用Kaplan-Meier法绘制,组间差异采用Log-rank检验。结果1.肿瘤组织mld的形态特征正常结直肠黏膜podoplanin阳性染色淋巴管常位于黏膜下,多呈扩张状,形态大小不一,壁较薄(图1)。结直肠癌组织中也可见明确的podoplanin阳性淋巴管,其数目和分布具有明显的异质性(表1),表现为:(1)数目的差异:肿瘤边缘组织中微淋巴管数最多,其次为肿瘤浅表部,而肿瘤中心区最少,各组MLD均值比较差异具有统计学意义(P<0.01);(2)形态的差异:肿瘤边缘可以见到较多管腔扩张的淋巴管(图2),而肿瘤中心及浅表部淋巴管则多为闭锁的条索状(图3)。96例结直肠癌总平均MLD均值为33.6±17.2,其相应正常结直肠组织MLD均值为29.4±9.0,两组MLD均值间差异无统计学意义(P>0.05),但肿瘤边缘MLD均值较正常结直肠组织非常显著地增高(P<0.01),而肿瘤中心区MLD均值显著低于正常组织(P<0.01),肿瘤浅表区MLD均值与正常组织者差异无统计学意义(P>0.05)。正常结直肠黏膜和癌组织内具有丰富的CD34阳性表达血管(图4),癌组织中血管的分布特点与淋巴管类似,同一肿瘤内也存在分布与数量的差异,其中肿瘤边缘区微血管数最多,肿瘤中心区最少,肿瘤浅表区微血管数介于两者间,各组间MVD均值经统计学处理,肿瘤边缘组显著高于肿瘤中心组和肿瘤浅表组(P<0.05)。结直肠癌总的MVD均值为44.5±22.6,显著高于正常结直肠MVD均值32.6±12.1(P<0.05),且肿瘤边缘区MVD均值与正常结直肠比较差异有统计学意义(P<0.01)。podoplanin与CD34双标免疫组织化学显示淋巴管呈蓝紫色,血管呈鲜红色,两者无交叉反应(图5)。2.淋巴管内皮ki-97表达podoplanin和Ki-67双标染色显示结直肠癌淋巴管内皮细胞核呈不同程度的Ki-67表达(图6),而正常结直肠淋巴管几乎没有Ki-67表达,二者差异显著。96例结直肠癌不同区域淋巴管内皮Ki-67指数有所差异,肿瘤边缘区最高,肿瘤中央区最低,边缘区淋巴管内皮Ki-67指数显著高于浅表区和中心区(P<0.05)。结直肠癌血管内皮Ki-67指数显著高于正常结直肠组织(P<0.01),但结直肠癌各区域血管内皮Ki-67指数差异无统计学意义(P>0.05,表1)。3.结说肿瘤边缘区mld的比较表1不同性别、年龄患者以及不同部位肿瘤结直肠癌间总的MLD均值差异无统计学意义,在不同肿瘤大小、分化程度、Dukes分期、有无淋巴管/血管受累、淋巴结/远处转移结直肠癌间差异也无统计学意义。但分析结直肠癌不同区域的MLD显示,结直肠癌边缘区MLD与淋巴管受累、淋巴结转移及远处转移有关,伴淋巴管受累和淋巴结转移组,其肿瘤边缘区MLD较无淋巴管受累和无淋巴结转移组均显著增高(P<0.01);伴远处转移者,其肿瘤边缘MLD也显著高于无远处转移组(P<0.05),而有无血管受累组间边缘区MLD均值差异无统计学意义(P>0.05)。结直肠癌组织总MVD和不同区域MVD值,在不同肿瘤大小、分化程度、Dukes分期间,以及有无血管受累、远处转移组间差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),而在有无淋巴管受累和淋巴结转移组间差异无统计学意义(P>0.05)。4.mld与预后的相关性og-raken检验根据结直肠癌组织不同区域和总的MLD或MVD计数中位值,将癌组织分为高、低MLD和MVD组,分别绘制其Kaplan-Meier生存率曲线图,经Log-rank检验显示所有结直肠癌组织以及肿瘤中心区、浅表区,高MLD组与低MLD组间,其患者5年生存率差异无统计学意义,但肿瘤边缘区MLD与患者预后显著相关(图7),高MLD组5年生存率(52.1%)显著低于低MLD组(70.8%,P<0.05)。Log-rank检验显示结直肠癌组织不同区域MVD和总的MVD与患者预后有关,分析结直肠癌总MVD,显示高MVD组5年生存率(50.0%)显著低于低MVD组(72.9%,P<0.05)。抗podopl现行新近发现肾小球足细胞膜上的黏蛋白podoplanin,仅表达于淋巴管内皮,而在血管内皮无表达。2001年,Schoppmann等首次应用抗podoplanin抗体标记淋巴管获得成功。研究显示podoplanin除表达于皮肤某些血管内皮外,尚未发现其他器官血管的表达。我们采用鼠抗人podoplanin和CD34单克隆抗体对结直肠癌组织同一切片淋巴管和血管进行双标染色显示两者间无交叉反应,表明podoplanin对淋巴管标记具有特异性。1.实体肿瘤内淋巴管内皮细胞肿瘤血管生成已被证实在肿瘤发生、发展和转移中具有非常重要的作用。但肿瘤淋巴管生成的研究才开始起步。部分学者认为由于肿瘤内部的高压力,淋巴管管腔应该塌陷且不能进入实体肿瘤内,恶性肿瘤主要是通过肿瘤边缘正常组织内的毛细淋巴管引起淋巴结转移。部分研究者甚至认为,瘤体内出现间质水肿、瘤内高压的主要因素除肿瘤细胞增殖外,与肿瘤区血管通透性高,而瘤内缺乏有效淋巴循环有关。关于“实体肿瘤内是否存在淋巴管?即便存在,这些淋巴管究竟为残留或是新生?”等问题一直存在争议。近年来,随着VEGF-C和-D的克隆成功以及淋巴管内皮细胞特异标记物(如podoplanin、prox-1和LYVE-1)的相继发现,逐渐为肿瘤淋巴管生成研究提供了较为可靠的手段。随后的一系列研究发现实体肿瘤内确实存在淋巴管以及新生淋巴管。我们研究发现结直肠癌淋巴管分布具有异质性,其中肿瘤边缘区淋巴管最丰富,而肿瘤浅表区淋巴管较稀疏,中心区最少,有的甚至完全缺乏淋巴管,这可能与肿瘤内增高的压力有关。进一步检测这些淋巴管内皮细胞核增殖活性,发现结直肠癌组织中淋巴管内皮Ki-67表达较正常结直肠组织显著增强,其中又以肿瘤边缘区Ki-67指数最高。结直肠癌淋巴管内皮细胞Ki-67表达增强提示癌组织中存在新生淋巴管,可能以癌周区淋巴管生成为著。2.新生淋巴管恶性肿瘤(尤其是癌)早期转移主要表现为经淋巴管向局部淋巴结转移。肿瘤淋巴管生成是否也增加淋巴结转移的可能性呢?有人对乳腺癌、胃癌、口咽部癌和黑色素瘤研究显示肿瘤内MLD与淋巴结转移显著相关。研究还发现肿瘤新生淋巴管仅单层内皮细胞,内皮细胞间的连接不紧密,缺乏连续的基底膜;同时肿瘤组织间质液压通常增高,使连接淋巴管内皮细胞和周围结缔组织的锚丝的张力增加,造成内皮细胞间的开放连接增多、间隙增大。正是这些特点,使淋巴管抵御肿瘤侵入的能力非常弱,为肿瘤细胞的转移提供了有利的通道。He等采用动物模型研究提出对肿瘤淋巴结转移而言,新生的淋巴管是必需的。我们发现结直肠癌不同区域MLD与淋巴结转移的关系有所差异,肿瘤中心区和浅表区MLD与转移之间无显著相关性,但是肿瘤边缘区MLD增加与淋巴管受累和淋巴结转移密切相关。因此结直肠癌边缘区MLD测定对判断其是否发生淋巴结转移可能具有意义。3.结高校肿瘤淋巴管密度与患者预后的关系目前对于肿瘤淋巴管密度与患者预后关系研究相对较少,且结论也不一致。Birner等在宫颈癌的研究显示MLD增加不影响宫颈癌进展,而与患者的良好预后有关。但一些动物实验则得出与之相悖的结论。Munoz-Guerra等对6