褐菖鮋联苯菊酯抗氧化防御系统

摘要联苯菊酯是使用最为广泛的除虫菊酯类农药之一，其主要用途包括果树、庄稼的虫害防治，也用于杀灭白蚁、螨虫等室内有害昆虫。实验以环境浓度(1、10、100ng·L-1)的联苯菊酯对褐菖鮋各自进行7d、15d、30d、50d的慢性水体暴露后检测褐菖鮋脑组织主要抗氧化防御系统指标的变化。实验结果显示：低浓度的1ng·L-1组在7d、15d的暴露时间以及中浓度的10ng·L-1组在7d的暴露时间GSH、GSTs与MDA呈应激反应现象，在30d、50d的暴露时间则呈中毒现象；中浓度的10ng·L-1组只在7d的暴露时间呈应激反应现象，其余暴露时间均呈中毒现象；而高浓度的100ng·L-1组在各取样时间均表现为中毒现象。结果表明：BF对鱼类具有很高的毒性，水体的BF暴露可对褐菖鮋抗氧化防御系统的功能造成损伤。关键词：褐菖鮋；联苯菊酯；抗氧化防御系统AbstractBifenthrin(BF)isapesticideofpyrethroid,anditismainlyusedforpreventandcontrolofdiseasesandpestsofcropsandfruiter,andcanbeusedtopreventharmfulinsectliketermitesandmitesinourdailylife.WedidtheexperimenttotesttheinfluenceofBFtotheindexofantioxidantsysteminthebraintissueofSebastiscusmarmoratus.TheSebastiscusmarmoratusisexposedtodifferentrelativeconcentration(1,10,100ng·L-1)todowaterexperimentfor7days,15days,30daysand50days.Theresultshowsthatin7daysor15days,theGSH,GSTandMDApresentedstressreactionphenomenoninlowconcentrationof100ng·L-1whiteitappearedpoisoningsymptomwhenSebastiscusmarmoratusisexposedtowaterfor30daysand50days.However,themediumconcentrationof10ng·L-1groupandhighconcentrationof100ng·L-1grouppresentedstressreactionphenomenonmerelyin7days’test,andothergroupsallappearedpoisoningsymptom.TheresultofthisexperimentshowsthatifBFwereexposedtowaterinlong-term,thefunctionofdefensesystemofantioxidantsysteminthebraintissueofSebastiscusmarmoratuswouldbedamaged.keywords:Sebastiscusmarmoratus;Bifenthrin;Antioxidant

defense

system目录1引言 12材料与方法 22.1药品和试剂 22.1.1药品 22.1.2试剂 22.2实验仪器 22.3实验方法 22.4实验用鱼与暴露实验的设计 32.5实验数据处理 33结果分析 33.1BF的暴露对褐菖鲉脑组织GSH含量的变化 33.2BF的暴露对褐菖鲉脑组织GSTs含量的变化 53.3BF的暴露对褐菖鲉脑组织MDA含量的变化 64讨论 75结论 7致谢 8参考文献 9PAGE10联苯菊酯对褐鲳鮋脑组织抗氧化防御系统的影响1引言海洋环境因其较少受到陆源性污染源影响且自净能力强而成为相对稳定的生态系统，但随着人类对环境资源开发力度的加剧而受到日益严重的污染。特别是20世纪以来随着海洋开发力度的加大，海洋环境正承受着越来越多的农药、重金属以及其他多种工农业污染源的影响。在这些污染源中，农药污染较为突出，农药及其容易通过雨水、江河径流或地下水等途径进入，从而威胁海洋水体环境[1]。据孙广大[2]对福建省厦门西海岸和九龙江河口水体（包括沉积物）的分析，该水域和沉积物检出的农药有103种，这其中包括9种除虫菊酯类农药。在这9中除虫机制类农药中，水体中联苯菊酯（Bifenthrin，BF）含量达到9.1ng·L-1，沉积物中最高更是达到21µg·kg-1，因此农药对水环境的影响应给予重视。BF作为常见的拟除虫菊酯类的农药在农业生产中经常使用，是可用于防治多种害虫的广谱杀虫剂，其主要用途包括果树、庄稼的虫害防治，也用于杀灭白蚁、螨虫等室内有害昆虫[3]，由于该类农药具有生物活性优异、环境相容性好等优点，逐渐成为使用最广泛的杀虫剂[4]。但是，农药的开发和使用所带来的生态环境问题不应被忽视，根据张秀玲[5]的报道，生产上施用的农药只有少量被靶生物吸收，绝大多数扩散或流失于土壤、地下水或近海海域等自然环境，造成水体、空气、食品等的污染。尽管该农药能够有效的抑制农作物的病虫害问题，但它本身在自然条件下残留时间较长而且不易被分解，所以使用不当极容易在土壤和水体中产生大量残余物质，将会对动、植物的生长造成一定的威胁。已有的研究显示[6]，BF在含水率为20%的沙土与有机土壤土壤半衰期（half-lifeperiod）分别411d和522d，被水浸没土壤半衰期大致亦有267d。从这些数据可以看出，BF在水体中更不容易被分解，因此长期使用该类农药对鱼类等水生物和水体环境造成的影响是十分巨大的。生物有机体抗氧化防御系统（antioxidantsystem）包括抗氧化酶系统和非抗氧化酶系统2种类型，后者包括超谷胱甘肽（GSH）、氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等3个指标，前者的主要指标包括β胡萝卜素与维生素等[7]。鱼类在环境毒物的胁迫下，其抗氧化防御系统的相应指标会出现上升或下降，这些指标的变化可引起机体过氧化反应从而导致机体损伤[8]。本实验选取谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、丙二醛（MDA）三个相关抗氧化防御的标志性指标在BF水体慢性暴露后的变化来验证该药物对鱼类抗氧化防御系统影响。褐菖鲉（Sebastiscusmarmoratus）是我国东南海常见经济鱼类，因其体型较小、软胎生适合开展毒理学研究，因此褐菖鮋是海洋环境毒理学研究的理想模式生物[9-11]，根据这一特点我们的实验以水体环境浓度（1、10、100ng·L-1）的BF对褐菖鮋进行慢性暴露实验，探究BF对鱼类主要抗氧化系统指标的影响，以期对除虫类菊酯农药的使用所引起的生态问题进行评估。2材料与方法2.1试剂与药品2.1.1药品（BF）联苯菊酯（BF）：分析纯，为Dr.Ehrenstorfer（德国）公司产品，原药纯度≥99.5%；使用前以有机溶剂乙腈配置成储备液，储备液浓度梯度为0.25，2.5，25µg·ml-1，配制后封闭保存于4℃冰箱待用。实验所需的其他药品购自国内厂家，均属分析纯。2.1.2试剂盒相关指标的测定均采用试剂盒，实验所需的试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。蛋白测定所使用的的牛血清白蛋白、考马斯亮蓝G250为上海生物工程有限公司产品。2.2仪器设备离心机（3-18K）：德国sigma公司产品；紫外可见分光光度计（UV2550）：日本岛津公司产品。2.3实验方法相关指标的测定以试剂盒使用说明书的方法测定GSTs、MAD、GSH等指标。各组实验数据的采集以6个平行样（n=6）进行平均取其均值。2.4实验用鱼与暴露实验的设计以砂滤海水为驯化与暴露实验用水，驯化开始前将砂滤海水用事先经过24h曝气的干净淡水将盐度调节为23-24。驯化实验：将实验用褐鲳鮋分成乙腈溶剂对照组、1ng·L-1组、10ng·L-1组与100ng·L-1组等4缸。每个缸实验水体容积为60L，以1尾鱼2L水体的量在每个缸随机放入褐鲳鮋30尾先进行驯化实验，驯化时间7d。待实验用于适应室内环境后进行暴露实验。暴露实验：驯化实验结束后以低浓度组（1ng·L-1）、中浓度组（10ng·L-1）及高浓度组（100ng·L-1）分别加入200μL预先配制的0.25、2.5、25μg/mLBF应用液，而对照组加入等量容积（200μL）的乙腈溶剂，并及时将缸内实验水体混匀。暴露实验过程中需每天更换一半的实验海水（30L），并补充一半剂量的BF药物。实验过程每天换水前2h按照褐鲳鮋体重2%-3%的比例投喂鱼配合饲料，换水的同时以虹吸管将水缸底部的鱼粪便以及未食用的饲料残饵虹吸干净。暴露实验过程中每7d彻底清洗玻璃水缸并全部更换玻璃钢内的海水与BF药物。整个暴露实验时间50d，暴露实验结束之后杀鱼并取其脑用作实验样品，取出的试验样品立即用液氮速冻后于-80℃超低温冰箱保存待用。暴露实验期间需以增氧设备对个缸水体进行不间断充气以保证实验水体供养充足。2.5实验数据处理实验数据的获取:以平均值±标准误差（mean±SE）表示；实验数据的分析：以spss17.0软件进行计算和分析，组间数据的处理与分析采用单因素方差(Duncan’s法)，P＞0.05则差异不显著，P<0.05为差异显著。3结果分析3.1BF的暴露对褐菖鲉脑组织GSH含量的变化图3-1为褐菖鮋在经过BF50d暴露后其脑组织GSH活力的变化.试验的结果显示，BF对褐菖鮋脑组织GSH活性具有显著的抑制作用，脑组织GSH活性的抑制与药物呈剂量依赖性关系，且各浓度组脑组织GSH活性与对照组比较均呈现极显著下降.其中对照组GSH在暴露7d时活性为（16.8±3.76）nmol·mg-1，低浓度（1ng·L-1）组GSH活性为（20.06±2.26）nmol·mg-1，中浓度（10ng·L-1）组GSH活性为（24.68±4.78）nmol·mg-1，高浓度（100ng·L-1）组GSH活性为（5.56±1.12）nmol·mg-1；对照组GSH在暴露15d时活性为（15.85±2.66）nmol·mg-1，低浓度（1ng·L-1）组GSH活性为（24.25±2.65）nmol·mg-1，中浓度（10ng·L-1）组GSH活性为（14.55±2.15）nmol·mg-1，高浓度（100ng·L-1）组GSH活性为（4.74±0.87）nmol·mg-1；对照组GSH在暴露30d时活性为（16.06±3.53）nmol·mg-1，低浓度（1ng·L-1）组GSH活性为（11.98±3.33）nmol·mg-1，中浓度（10ng·L-1）组GSH活性为（8.32±0.82）nmol·mg-1，高浓度（100ng·L-1）组GSH活性为（4.62±1.22）nmol·mg-1；对照组GSH在暴露50d时活性为（15.72±3.88）nmol·mg-1，低浓度（1ng·L-1）组GSH活性为（11.72±1.53）nmol·mg-1，中浓度（10ng·L-1）组GSH活性为（8.8±0.77）nmol·mg-1，高浓度（100ng·L-1）组GSH活性为（4.5±1.26）nmol·mg-1,经实验表明，30d和50d的GSH含量均较对照组呈现下降趋势，其中浓度为1ng·L-1时GSH下降不显著（p>0.05），而浓度为10ng·L-1时GSH呈显著下降（p<0.05），说明褐菖鲉在联苯菊酯中暴露30d后，脑组织的GSH浓度达到10ng·L-1以上时，将会被显著抑制。而在7d与15d时，相对应的GSH有上升的趋势，这是由于鱼类处于不同环境下会产生应激性，通过调节一些调节机制来保持内部条件的相对恒定，从而维持生命活动。当鱼类处于100ng·L-1时，无论暴露时间长短，GSH均呈显著下降（p<0.05）。说明高浓度的联苯菊酯对鱼类影响极大。图3-1联苯菊酯暴露对褐菖鮋脑组织GSH的影响(n=6,ab:p＞0.05,b:p＜0.05)3.2BF的暴露对褐菖鲉脑组织GSTs含量的变化图3-2为褐菖鮋在经过BF不同时间与与浓度暴露后其脑组织GSTs含量的变化，其变化趋势与GSH的趋势相似。结果显示，褐菖鮋经过BF暴露7d后，脑组织含量出现低、中浓度组持续上升而高浓度组下降的趋势，其中对照组GSTs活性为（78.06±8.56）U·mg-1，1ng·L-1组GSTs活性为（95.85±10.66）U·mg-1，较对照组出现上升但上升不显著（P＞0.05），10ng·L-1组GSTs活性为（116.66±9.53）U·mg-1，较对照组出现显著上升（P<0.05），而100ng·L-1组GSTs活性为（48.8±8.88）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05）；经过BF暴露15d后，脑组织含量出现低浓度组上升而中、高浓度组下降的趋势，其中对照组GSTs活性为（76.83±11.36）U·mg-1，1ng·L-1组GSTs活性为（106.32±12.78）U·mg-1，较对照组出现显著上升（P<0.05），10ng·L-1组GSTs活性为（63.38±8.36）U·mg-1，较对照组出现下降但下降不显著（P>0.05），而100ng·L-1组GSTs活性为（42.49±8.78）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05）；经过BF暴露30d后，脑组织含量呈现下降趋势，其中对照组GSTs活性为（77.64±12.78）U·mg-1，1ng·L-1组GSTs活性为（61.98±9.27）U·mg-1，较对照组出现下降但下降不显著（P>0.05），10ng·L-1组GSTs活性为（45.32±6.75）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05），同样的，100ng·L-1组GSTs活性为（38.16±3.57）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05）；经过BF暴露50d后，也呈现下降趋势，其中对照组GSTs活性为（77.52±6.49）U·mg-1，1ng·L-1组GSTs活性为（50.16±6.82）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05），10ng·L-1组GSTs活性为（38.45±4.56）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05），100ng·L-1组GSTs活性为（34.99±5.55）U·mg-1，较对照组出现显著下降（P<0.05）。图3-2联苯菊酯暴露对褐菖鮋脾脏组织GST活性的影响(n=6,ab:p＞0.05,b:p＜0.05）3.3脑组织MDA含量的变化各浓度组脑组织MDA含量的变化趋势如图3-3所示。在经过短暂的7d暴露后，脑组织的MDA含量呈现出先下降后上升的趋势，这其中对照组（ck）、低浓度的1ng·L-1组与中浓度10ng·L-1组的MDA含量分别为（6.12±1.56）、（5.68±1.26）和（4.26±1.13）nmol·mg-1，中、低浓度组MDA含量均出现下降，经spss分析显示低浓度组较对照组下降不显著（P＞0.05），但10ng·L-1的中浓度组MDA含量有显著下降（P<0.05），但高浓度组MDA的含量是（8.64±1.38）nmol·mg-1，经spss分析显著高于对照组（P<0.05）；而经过BF暴露15d后，出现低浓度组下降，但中、高浓度组上升的趋势，低浓度的1ng·L-1组以（4.32±0.68）nmol·mg-1的MDA浓度显著低于ck组的（6.45±1.36）nmol·mg-1（P<0.05），中浓度的MDA以（7.38±0.96）nmol·mg-1的浓度较对照组有所上升，但不显著（P>0.05），但高浓度组MDA以（8.49±0.78）nmol·mg-1的浓度显著高于对照组（P<0.05）；经过BF暴露30d后，脑组织的含量全部呈上升趋势，ck组与各实验组（低、中、高浓度）MDA的含量分别为（6.26±1.15）、（7.98±1.32）、（8.74±0.75）与（12.44±0.57）nmol·mg-1，除了低浓度组MDA浓度升高不显著（P>0.05）外，中、高浓度组的MDA浓度均出现显著性升高（P<0.05）。而经过BF暴露50d后，对照组与3个药物浓度组MDA的含量分别为（5.51±0.49）nmol·mg-1和（7.16±0.82）、（9.45±1.05）与（12.99±1.55）nmol·mg-1，所有药物组MDA均显著高于ck对照组（P<0.05）。图3-3联苯菊酯暴露对褐菖鮋脑组织MDA活性的影响(n=6,ab:p＞0.05,b:p＜0.05）4讨论GSH存在于所有动物细胞中，是一种抗氧化剂，可以保护蛋白质分子中的-SH免遭氧化，维持红细胞膜的完整性和保护红细胞免受氧化剂的损害。[12]GSTs可将一些药物、致癌物等多种亲电子疏水性化合物与GSH结合成易于排泄的物质，保护亲和物质等。[13]当褐菖鲉处于有毒环境时，其体内的GSH和GSTs会产生一定的应激反应，也会受到污染物的毒性作用而产生中毒反应。而MDA则是作为细胞脂质过氧化的代谢产物，可以与蛋白质的游离氨基作用引起蛋白质分子内和分子间交联，从而使细胞膜损伤，因此其含量的高低体现了机体细胞膜受到自由基攻击而损伤的程度[14-15]，即表示细胞膜的受损程度。从实验结果可以看出，GSH、GSTs、MDA三种指标的浓度和效用具有一定联系，其中GSH和GSTs都随着海水中联苯菊酯的浓度的升高而降低，而MDA则是呈现相反的效果。从显著性分析中可以看出，GSH和GSTs对联苯菊酯的反应类似，在暴露7d时10ng·L-1组出现显著变化，而15d时在1ng·L-1时变出现显著变化。说明在较低的联苯菊酯浓度就能明显的影响GSH和GSTs的活性，从而影响GSH的保护能力和GSTs的催化能力，进而影响褐菖鲉脑组织的抗氧化能力。当浓度增加到10ng·L-1时，褐菖鲉的MDA含量出现显著变化，并且当GSH和GSTs下降时MDA含量增多，说明组织中脂质的多不饱和脂肪酸与自由基反应，并发生脂质过氧化，产生复杂脂质降解，产物主要是MDA(丙二醛)，MDA含量较大程度的增加说明细胞膜已经出现较大程度的损伤，细胞的抗氧化系统进一步受到损伤，影响了脑组织的正常功能，进而影响褐菖鲉的生长。实验表明，联苯菊酯是先影响褐菖鲉抗氧化防御系统中GSH和GSTs的活性，进而使自由基和活性氧的能力下降，导致产生MDA，使得细胞膜受损，进而影响褐菖鲉的正常生活。所以褐菖鲉的生活环境中若存在低浓度的联苯菊酯就会影响其脑组织的正常生活，但由于联苯菊酯浓度在1ng·L-1时对其脾脏的GST就有显著性的降低的趋势，所以，海水中若联苯菊酯的含量不得超过1ng·L-1。在生活中，特别是农业发达的地区，对联苯菊酯的用量较大，所以在此范围内应注意联苯菊酯的使用量，采用更为环保的方式取代。5结论通过BF在不同时间与浓度暴露后褐菖鮋脑组织主要抗氧化防御指标的检测，显示BF在低浓度条件下短时间的暴露褐菖鮋主要抗氧化指标可出现短暂的诱导性反应，但在长时间的慢性暴露条件下，褐菖鮋主要抗氧化防御指标表现为中毒症状，而BF浓度在100ng·L-1浓度条件下短时间的急性暴露也可引起中毒症状，抗氧化防御系统受到损伤，显示BF对鱼类具有很高的毒性。参考文献[1]孙肖瑜,王静,金永堂.我国水环境农药污染现状及健康影响研究进展[J].环境与健康杂志,2009,26(7):649-652.[2]孙广大.九龙江河口及厦门西海域水环境中103种农药污染状况及其初步风险评价[D].厦门:厦门大学,2009.[3]GuangYQ,ChenJM,TangJH,etal.Immobilizingbifenthrinonwoodfortermitecontrol[J].InternationalBiodeterioration&Biodegradation,2011,65(3):389-395