发酵工程第二章发酵工业微生物菌种

第二章发酵工业微生物菌种

制备原理与技术第二章第一节发酵工业微生物菌种的选育第二节工业微生物种子的扩大培养第三节种子培养基及其制备第一节发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏一、工业微生物的特点我们把用于发酵工业的微生物也叫做工业微生物。工业微生物具备个体小、种类多、繁殖快、分布广、代谢强和易变异等特点。发酵工程是以微生物的生命活动为中心的，各种发酵生产都必须有相应的微生物。所以微生物对于发酵过程就十分重要。发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏二、发酵工业常用微生物菌种及要求微生物菌种能否满足工业生产的实际需求，是否有工业生产价值是极为重要的。发酵工业对菌种的要求：能在廉价原料制备的培养基上迅速的生长并生成所需的代谢产物，而且产量高；培养条件易于控制；生长迅速，发酵周期短；满足代谢控制的要求；发酵工业对菌种的要求抗噬菌体和杂菌的能力强；遗传性状稳定，不易变异退化；在发酵过程中产生的泡沫要少，这对提高装料系数、提高单产量、降低成本有重要意义；对需要添加的前体物质有耐受能力，并且不能将这些前体作为一般碳源使用；不是病原菌，而且在系统发育上与病原菌无关，不产生任何有害的生物活性物质。具备以上条件的微生物才能保证发酵产品的质量和产量。二、发酵工业常用微生物菌种及要求不是所有的微生物都能用于发酵工业，目前工业上能利用的微生物菌种只有区区数百种。工业上常用的微生物菌种：细菌：bacteria工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、乳酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于生产酶制剂、乳酸、醋酸等。酵母菌yeast工业上常用的酵母菌有啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等，用于酿酒、制造面包、酶制剂和生产菌体蛋白。工业上常用的微生物菌种霉菌：mould工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸和甾体激素等。放线菌：actinomycetes

工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。担子菌：basidiomycetes

即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、药物开发。藻类：alga工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等，主要用于生产食品，替代能源等。发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏三、发酵工业微生物菌种的

分离和选育工业生产使用的菌种，有两种来源：根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。对于从自然界中分离筛选新的微生物菌种，必须制定相应的策略，才能保证好的结果。三、发酵工业微生物菌种的

分离和选育（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的选育（一）微生物菌种的分离自然界获得的微生物样品通常都是许多种微生物共存，必须把目标菌种与杂菌分开，才能用于生产。目前进行微生物分离的方法主要包括两个：施加选择性压力分离法随机分离法这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多步骤。新种分离与筛选的步骤定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离：利用分离技术得到纯种。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的步骤。到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样中所包含的所有微生物总数和种类。在任一试样中所存在的微生物仅为极少数特定种类的菌株；在工业微生物筛选过程中，应及时调整检测方法，以与各种不同类型的生长和代谢之微生物相适应。因此，建立更为科学的和针对性不强的分离方法是必要的。新种分离与筛选的步骤

（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主；富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。新种分离与筛选的步骤（一）采样2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。新种分离与筛选的步骤（二）增殖培养为了容易分离到所需的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。新种分离与筛选的步骤（三）培养分离尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。新种分离与筛选的步骤施加选择性压力分离法施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而快速分离纯化的目的。此方法一般用于富集培养，即采集样品后的第一步，可以使样品中目标微生物能大量繁殖。目前，分离培养基中也广泛加入选择性压力因素，进一步获得目标微生物。（四）筛选这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。新种分离与筛选的步骤（五）毒性试验自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。新种分离与筛选的步骤不同微生物分离的方法细菌的分离放线菌的分离霉菌的分离

(一)采样和采集方法为了从一特定生态系统中分离出具有代表性的细菌菌群，特别是分离那些在唯一微环境区域中出现的菌群时，必须十分重视样本的采集。样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。细菌的分离采样的注意事项1、采样时应尽可能保持相对无菌；2、所采集的样本必须具有某种代表性；3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长细菌的分离土样采集方法森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺序采集；水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留的土，这部分即为根际土样。植物体采集方法在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块，并注意不要损伤周围边缘。选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一片叶上的取样部位。采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般与根际土样一起保存。

水样采集方法用于细菌检测的水样应收集于100ml干净、灭菌的广口塑料瓶中。由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水层中采集水样。方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话，应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。玻璃水样采集器不锈钢水样采集器卡盖式水样采集器培养基的组成原则1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响实验中所要分离的细菌的数量和种类。2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物，部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤维素或果胶。3、所有分离培养基中都应含有抗真菌剂(如放线菌酮和制霉素)，掺加浓度一般为50μg／m1，以抑制真菌的生长。4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、2天。5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调节到与试样的生态系统参数值相近。培养基的组成原则土中细菌的富集培养与分离分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集。但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富集技术。富集可以促进抗性的产生并维持下来。水中细菌富集技术在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期取样涂布适宜分离琼脂平板上；在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白质等，同样可以促进水中微生物的增殖。培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如无菌的植物组织或土壤浸出液。通过改变培养温度和培养周期可选择性富集嗜冷性细菌、中温菌和嗜高温菌。次代培养及纯化步骤1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对琼脂平板进行分类。2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征如色素、菌落形态等进行最初分组。4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离琼脂平板上进行筛选。不同微生物分离的方法细菌的分离放线菌的分离霉菌的分离放线菌的分离(一)采样及采集方法应尽可能实行无菌操作。所采集的样本应具有一定的代表性。样本采集完后，应及时处理或在4℃下贮存，贮存试样处应与划线，筛选平板分开，贮存时间不宜过长。(二)生态学参数放线菌分离培养过程中所需考虑的生态参数有温度、pH、离子强度、氧化还原电势和底物浓度。（三）培养基的组成原则大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓慢形成菌落。在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。选择性地添加抗生素。分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养箱中存放3天。放线菌的分离放线菌的分离土样中放线菌的非选择性分离：土样风干，磨碎，无菌海绵压印土样后压印平板后培养。植物体上放线菌的分离：无菌取植物组织，干燥以减少细菌数量，剪碎植物材料后植入平板表层后培养。也可洗下微生物后振荡培养。水中放线菌的分离：为使所要分离的放线菌的数量种类增多，一般将水样离心或滤纸过滤，取离心沉积或滤纸表面沉积进行稀释和涂布。次代培养及纯化菌落形成后可根据肉眼可见的菌落形态上的差异，作初步的鉴定和区分。通过高倍放大进行镜检，可了解气生和营养孢子形成情况。成功地分离出各种不同的放线菌属及种的关键是所采集样本的本身及其分离用的琼脂培养基；而肉眼识别不同的生长形态、从而初步地加以鉴定，在分离放线菌时尤为重要。将分离平板上所形成的菌落用经火焰灼烧灭菌的钩形针或无菌牙签挑取，点接到琼脂平板上进行影印培养，以进一步筛选和分离。不同微生物分离的方法细菌的分离放线菌的分离霉菌的分离真菌分离1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散，利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。3、有时，真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养时应加以考虑。4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微生物数量上的增加而利于分离的一种技术。

富集可以是种水平的，如通过营养要求的改变来富集分离镰刀菌；也可以是组成群水平的，如以纤维素为唯一碳源的选择性培养基可选择性富集所有能降解纤维素的纤维素裂解微生物。5、选择性抑制培养基可使非目标微生物消除或减少到一定程度。在分离培养基中加入一定的抗生素即可有效地抑制细菌生长及菌落形成。真菌分离真菌的分离方法土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法，浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离心法。植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法，浸泡法。水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸上培养。随机分离法有些微生物在分离和筛选的时候并不是采用传统的选择性压力分离法，只能采用随机法进行分离。抗生素产生菌的分离抗肿瘤药物产生菌的分离酶抑制剂产生菌的分离抗病毒药物产生菌的分离生长因子产生菌的分离免疫激活剂产生菌的分离多糖产生菌的分离抗生素产生菌的分离抗生素产生菌筛选方法包括：抑菌圈法、稀释法、扩散法、生物自显影法等等。如抑菌圈法，由于抗生素产生菌会产生抗生素，因此事先在平板上涂抹适当的供试菌（对抗生素敏感），如果待分离的微生物能够在菌落周围形成抑菌圈，即说明是具有抗生素产生能力的菌种。另外也可以采用专一性很强的筛选技术，如采用与抗生素作用机制相关的酶进行筛选。抗肿瘤药物产生菌的分离大部分抗肿瘤药物也具有抗菌和抗真菌活性，目前利用微生物筛选作用于DNA的抗肿瘤药物的方法具有高灵敏度和简便快速的特点，如生化诱导分析法和SOS生色检测法。生化诱导分析法也叫λ诱导检测法，通过测定表达的β-半乳糖苷酶活性，来检测能损伤DNA的抗肿瘤药物的存在。此外也可利用DNA修复能力突变株进行抗肿瘤药物的筛选。酶抑制剂产生菌的分离酶抑制剂产生菌的筛选，主要选择与生理和病理关系明确的酶为靶酶进行筛选。如可以用前列腺素合成酶、血管紧张素转移酶等等作为靶酶，选择产生酶抑制剂的微生物。三、发酵工业微生物菌种的

分离和选育（一）微生物菌种的分离（二）微生物菌种的选育（二）微生物菌种的选育工业菌种的育种：是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。工业菌种的选育包括如下几个方法：自然选育、诱变选育、抗噬菌体菌种选育、杂交育种、原生质体融合技术和基因工程技术。1、自然选育不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程叫自然选育。自然突变可能会产生两种截然不同的结果，一种是菌种退化而导致目标产物产量或质量下降，另一种是对生产有益的突变。自然选育的突变率虽然很低，但是却是工厂保证稳产高产的重要措施。自然选育还要注意生产菌种的回复突变。2、诱变选育利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需的高产优质菌种的育种方法。诱变育种包括诱变和筛选两部分。诱变成功的关键，包括以下几个步骤：出发菌株的选择，一定要考虑目标产物的生产能力，其他因素尽量考虑利于诱变。诱变剂使用方法，有单一诱变剂和两种以上的诱变剂联合使用两种方法。诱变剂的剂量选择：诱变剂剂量与致死率有关系，同时与突变率有关系，所以一定要选择合适的使用剂量。2、诱变选育2、诱变育种诱变处理结束之后，菌种有可能发生很多类型的变异，正向突变的菌种往往占少数，必须通过初筛和复筛之后在经过发酵条件的优化研究，确定最佳的条件，才能使高产菌株发挥生产能力，不同菌株可以根据特性不同采用不同的筛选方法，如营养缺陷型、抗反馈阻遏和抗反馈抑制型、组成型突变株、抗性突变株等类型。营养缺陷型突变株筛选营养缺陷型突变株由于生物合成途径中某一步发生了酶缺陷，合成不能完成，末端产物不能积累，因此末端产物的反馈调节作用被解除。在培养基内限量加入所要求的末端产物，克服生长障碍，就能积累所需的中间产物。筛选时则可以利用这个营养缺陷作为条件，筛选出突变株。诱变、淘汰野生型、检出缺陷型、确定生长谱即为营养缺陷型菌株诱变育种的基本步骤。营养缺陷型突变株育种过程淘汰野生型的方法：抗生素法：野生型能在基本培养基中生长，而缺陷型不能，于是将诱变处理液在基本培养基中培养短时让野生型生长，处于活化阶段，而缺陷型无法生长，仍处于休眠状态。由于细菌或酵母对一些抗生素敏感，于是就相应加入一定量的抗生素，结果活化状态的野生型就被杀死，保存了缺陷型。一般细菌可以采用青霉素，酵母可采用制霉菌素。菌丝过滤法：对于霉菌，因孢子生长后会长出菌丝体，就可用滤纸过滤法将菌丝滤去，而缺陷型孢子却因未发芽而能滤过。营养缺陷型突变株育种过程营养缺陷型的检出：原理：在固体基本培养基和完全培养基上，生长情况完全不同，缺陷型在CM上生长良好，而在MM上则不生长，野生型都能生长。具体方法：影印法、点种法、夹层法营养缺陷型突变株育种过程生长谱确定验证确定是缺陷型后，就需确定其缺陷的因子，即生长谱测定。利用固体培养基，点不同的生长因子，观察菌种的生长情况，来确定具体缺陷的因子。抗反馈阻遏和抗反馈抑制型抗反馈阻遏和抗反馈抑制是指能使积累了大量末端产物的时候仍能不断合成这一产物。筛选这类突变菌株是通过抗结构类似物突变的方法完成的。未突变的细胞会因为代谢受阻，不能合成某种代谢产物而死亡，突变株仍能够合成相应的末端产物，形成菌落，便于区分。组成型突变株的筛选组成型突变株是为了解除菌株对诱导物的依赖而获得的，因此可以选择设计一种利于其生长并限制诱导型菌株生长的培养条件，来达到筛选的效果。交替培养法就是筛选组成型突变株的有效方法。如β-半乳糖苷酶的组成型突变株和诱导性菌株就可以用这种方法区分。抗性突变株的筛选这包括对抗生素、金属离子、温度、噬菌体等的抗性筛选，这些突变株筛选都比较容易，在培养基内加入相应的因子，即可去除掉野生型菌株。如抗生素抗性突变株的筛选，即在培养基内加入相应抗生素，比如加入青霉素，野生型的不能生长，而青霉素抗性突变株则可以生长。其他的抗性突变株的筛选方法类似。3、杂交育种杂交育种：利用不同菌株之间遗传物质的交换、重组，使不同菌株的优良性状集中在重组体中，获得新菌株的方法。可以克服长期诱变引起的生活力下降等缺点。杂交育种的优点杂交育种的基本程序杂交育种的方法杂交育种的优点可以通过育种使新菌株获得多个菌株的优良遗传性状；克服长期诱变造成的生活力下降，同时提高对诱变剂的敏感性，降低“疲劳”效应；总结遗传物质的转移和传递规律，丰富并促进遗传学理论的发展。杂交育种的基本程序标记亲和力A+

B+

C-

D-标记亲和力A-

B-

C+

D+A+B+

C+

D+杂交育种的方法杂交育种的方法包括如下几种：原核微生物：接合、转化、转导；真核微生物：有性生殖、准性生殖。大部分发酵工业中具有重要经济价值的微生物是准性生殖的方式进行杂交重组。4、原生质体融合技术原生质体融合技术提供了充分利用遗传重组杂交的方法，可以打破种属之间的界限，提高重组频率、扩大重组幅度。原生质体融合的优越性原生质体融合的方法原生质体融合的优越性受接合型或致育型的限制小，两亲株没有供体和受体之分，有利于不同种属微生物的杂交；重组频率比其他的杂交方法高；遗传物质传递更加充分、完善，既有质配也有核配；可以采用温度、药物、紫外线等处理纯化菌株的一方或者双方，然后再融合，提高筛选效率；用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。原生质体融合的方法原生质体制备：使用各种酶降解两个出发菌的细胞壁，释放出原生质体，同时释放到高渗溶液中。原生质体的融合与再生：通过化学因子或电场诱导进行融合。如聚乙二醇4000和6000并加入Ca2+和Mg2+，融合之后涂布在高渗培养基上，令其再生。融合子的检出：融合子在选择性培养基上检出，即通过两个遗传标记互补确定的选择性因素进行培养。发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏四、发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏微生物世代时间一般很短暂，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此常常造成工业生产菌种的退化，甚至可能使优良菌种丢失，所以如何保持菌种的优良性能和稳定成为关键。（一）微生物菌种的退化及原因（二）防止菌种退化及退化菌种的复壮（三）菌种的保藏（一）微生物菌种的退化及原因菌种退化：指在经过较长时间传代保藏之后，菌株的一个或多个生理性状和形态特征逐渐减退或消失的现象。引起菌种退化的原因：基因突变变异菌株性状分离连续传代其他因素（二）防止菌种退化及退化

菌种的复壮防止菌种退化的方法：控制传代次数：尽量避免不必要的接种和传代，在传代的时候尽量同时移植较多斜面菌种；选择合适的培养条件：选择一个适合原种生长的条件可防止菌种的衰退；利用不同类型的细胞进行传代：特定的菌株采用特定的细胞形式进行传代；选择合适的保藏方法。（二）防止菌种退化及退化

菌种的复壮退化菌种的复壮：使退化的菌种重新回复原来的优良特征，叫做复壮。常用的方法是对已退化的菌株用一定的培养条件进行单细胞的分离纯化，从而限制退化菌株在数量上的优势。（三）菌种的保藏菌种保藏的意义菌种保藏的原理菌种保藏的方法：斜面低温保藏法石蜡油封保藏法砂土管保藏法冷冻干燥法超低温保藏法冷冻干燥设备液氮设备发酵工业微生物菌种的选育工业微生物的特点发酵工业常用微生物菌种及要求发酵工业微生物菌种的分离和选育发酵工业微生物菌种的退化、复壮与保藏第二节工业微生物种子的扩大培养种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入固体试管斜面活化后，再经过摇瓶或者静置培养，以及种子罐逐级扩大而获得发酵量高、生产性能稳定、数量充足、不备杂菌和噬菌体污染的生产菌种的纯种制备过程。该纯种培养物即称为种子。种子必须满足一些条件才能进行工业发酵：总量适宜进行发酵，生命力旺盛，能保持稳定的生产性能，无杂菌和噬菌体的污染。工业微生物种子的扩大培养菌种扩大培养的任务种子制备的过程发酵工业种子培养影响种子培养的因素和种子质量的控制一、菌种扩大培养的任务菌种扩大培养的任务就是要为每只发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。发酵时间的长短与接种量的大小直接有关系，因此在种子扩大培养中必须获得纯而壮的种子，而且还要获得活力旺盛的接种量足够的培养物。具体接种量的大小要根据具体的发酵过程采用的菌种确定。工业微生物种子的扩大培养菌种扩大培养的任务种子制备的过程发酵工业种子培养影响种子培养的因素和种子质量的控制二、种子制备的过程种子的制备过程分为两个层次：实验室种子制备生产车间种子制备二、种子制备的过程1、实验室种子制备实验室种子制备包括琼脂斜面培养、固体培养基扩大培养和摇瓶液体培养等，目的是为种子罐提供种子。根据菌种的生理特性不同，提供给种子罐的菌种状态也不同，如产孢能力强的菌种、产孢能力弱的菌种、不产生孢子的细菌、酵母菌等。实验室阶段培养过程中，因为菌种和培养基的量较少，所以可以在无菌状态下直接接入，不用采用其他辅助条件。二、种子制备的过程种子的制备过程分为两个层次：实验室种子制备生产车间种子制备2、生产车间种子制备种子罐培养基：种子罐中应采用易被微生物吸收利用的成分为主，同时供给足够的无菌空气，最后一级种子罐培养基还应与发酵罐培养基基本一致；种子罐接种：孢子悬浮液采用微孔接种法，摇瓶菌丝体采用火焰保护接种或者压差法，种子罐之间采用压差法接种；种子罐级数：是指制备种子需要逐级扩大培养的次数，决定于菌种特性和发酵罐容积；微孔压差法接种接种针（含菌悬液或孢子悬液）插入，压力由0.5－0.6kg/cm2降至0.2kg/cm2

，当针插入橡皮塞后，茄子瓶与发酵罐压力平衡，降低罐压，使悬液注入。特点：操作方便，不易染菌，但不宜于菌丝体种子的接种。2、生产车间种子制备菌种的种龄：是指种子罐中培养的菌丝体转移下一级种子罐或发酵罐时的培养时间，一般采用对数生长期且培养液中菌体数量还未达到最高峰时为宜。种子罐和发酵罐的接种量：接种量是指移入的种子液体体积和接种后培养基体积的比例。接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。工业微生物种子的扩大培养菌种扩大培养的任务种子制备的过程发酵工业种子培养影响种子培养的因素和种子质量的控制三、发酵工业种子培养静置培养和通气培养种子扩大培养的方法深层培养法的基本操作控制点常用的液体深层培养法种子扩大培养的方法表面培养法：是一种好氧静置培养法，分液体和固体培养。氧的供给是发酵的限速原因，优点是不需要深层培养时的搅拌和通气，节省动力。固体培养法：分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养。优点是培养基组成简单，不易被细菌污染，容易调节通气状况。种子扩大培养的方法液体深层培养：从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解，称为深层培养法。载体培养法：来源于曲法培养，同时吸收了液体培养的优点，特征是以天然或