分子生物学实验技术

《分子生物学实验技术》实验报告实验一碱裂解法小量提取质粒DNA实验原理在碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。染色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提纯化得到质粒DNA。操作步骤主要步骤1.细菌的培养2.细菌的收集和裂解3.质粒DNA的分离和纯化4.质粒的鉴定具体操作如下：1.取1.5ml过夜菌液于EP管中，12000r/min离心1min，弃去上清液。2.加100μl溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀，室温放置5min。3.加200μl溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀4~6次，室温放置5min。4.加150μl预冷溶液Ⅲ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰上放置10分钟。5.12000r/m离心10分钟(如果上清液仍然浑浊，可将上清液移出，再次离心5分钟）。6.吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，室温放置10分钟，12000r/min离心10分钟，沉淀DNA。7.弃上清，挥干，所得DNA溶于30μlddH2O中，用于后续试验。三、实验结果获取极少量白色固体，主要为DNA，也不排除有蛋白质等杂质，但是不影响后续实验的继续进行。实验二氯化钙法进行质粒转化及筛选实验原理细菌处于0℃，在CaCl2低渗溶液中，菌体细胞膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。1.氯化钙（二价钙离子）的作用：提高细胞壁（膜）的通透性。2.热激后迅速转移到冰上：促使质粒DNA转移进入胞内。3.这种转化方法适用于双链环状DNA（质粒），线型DNA不能采用此法。（在自然界自然发生的转化过程中，进入细菌细胞中的为单链DNA）。二、试验方法1.感受态的制备（1）将大肠杆菌DH5α在LB平板上划线，37℃培养16~20hr（或过夜）。（2）从平板上挑取一个2~3mm大小的单菌落移至2~5mlLB液体培养基中，37℃强烈振荡过夜。（3）取1个三角瓶将菌液按1︰100稀释接种，37℃强烈振荡培养3hr，此时细菌OD600=0.4~0.6,为对数生长期。（4）将培养物置冰上10min后转移置离心管中,4000rpm,4℃离心5min。（5）弃上清，加入10ml(50ml原培养物)冰浴冷的0.1MCaCl2溶液,致敏悬浮细胞，置于冰上10min。（6）4000rpm,4℃离心5min回收细胞，弃上清，每50ml原培养物再加入2ml冰冷的0.1MCaCl2溶液，悬浮细胞。（7）按每份200ul分装细胞，若不24小时内进行转化,可在感受态细胞中加入终浓度为10%的灭菌甘油,置于-70℃冰箱保存。重复5-6的操作，以使反应更完全，增加成功率。2.质粒的转化（1）加10μl质粒DNA溶液至100μl感受态细胞中，温和混匀，置于冰上20min。（2）42℃热冲击90s，迅速放回冰上，将细胞冷却2~3min，加入500μlLB培养基。（3）将转化后细菌放置37℃，200rpm振荡培养45min，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。3.涂板筛选（1）取100μl转化混合物铺于LB+Amp（含有诱导物IPTG及生色底物X-gal）平板上，室温放置至液体被琼脂全部吸收，倒置平板于37℃培养12~16h(过夜)。（2）取出平板，观察平板上菌落的颜色和形状，挑选白色克隆进行PCR和质粒酶切验证。三、实验结果平板上可见分布不均匀的蓝色菌落。四、讨论含重组体的Puc18为白色菌落，含载体的puc18为蓝色菌落。若全为蓝色菌落，说明实验中治理的转化和筛选成功，如果有蓝白菌落混合，则说明实验失败。实验三全血DNA的提取及电泳一、实验原理由于血液各组分成分颗粒大小及比重不同，利用明胶的吸附作用，使红细胞沉积在管底，从而与白细胞相分离。通过SDS的破膜（细胞膜和核膜）作用，使白细胞释放出DNA。然后利用酚和氯仿抽提纯化，分离去除蛋白质。最后用乙醇沉淀洗出DNA。二、操作步骤1．分离WBC取1ml全血与明胶等体积混合，颠倒混匀，37℃静置5-10min，取上清液，4000r/min离心5min，然后弃去上清液。2．破碎WBC加入2mlTES,轻轻敲击管底震荡混匀，加入10滴10%SDS，颠倒混匀。3.抽提DNA加等体积Tris饱和酚,颠倒混匀100次，4000rpm离心5min,取上清液，加等体积氯仿：异戊醇（24:1），颠倒混匀100次，4000rpm离心5min，将上清移入玻璃试管。4.沉淀DNA加2.5倍体积无水乙醇，吸出絮状沉淀到1.5mlEP管，开盖通风橱内放置5min，挥干至无残余液体，加入100μІddH2O溶解。实验结果四、讨论1.左边的孔加的是扩增的PCR的产物，可见在最靠近孔处有一条带，是对应的产物。相邻的另一条带是扩增的质粒。（实验四的结果）2.第二个孔板里加的是全血DNA,所以可以看到DNA。实验四PCR-SSCP法检测人肥胖基因的点突变一、基本原理在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs，TaqDNA聚合酶，引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。二、实验方法1.PCR扩增靶DNA;2.将特异的PCR扩增产物变性，使之成为具有一定空间结构的单链DNA分子;3.进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳;4.最后通过银染显色分析结果。三、实验结果四、讨论（1）如图所示，