环丙沙星对猪链球菌病的缓解作用

环丙沙星对猪链球菌病的缓解作用

氨基丙沙星是氨基丙烯酸酯活性最强的品种之一。这是控制全身感染的药。以往的研究证明了这种抗高血压药物具有解决方案。0.1～100mg/ml的环丙沙星可降低人白细胞粘附性;其影响人中性多核细胞趋化性的程度属中等且取决于受试者个体差异;小鼠腹腔注射该药,5mg/(kg·d)给药组迟发型皮肤超敏(DTH)无反应,而10mg/(kg·d)给药组DTH反应被显著抑制,皮下注射,并不影响小鼠DTH反应;5～20μg/ml的环丙沙星能增强体外淋巴细胞增殖,达20μg/ml时,则对有丝分裂原刺激淋巴细胞分裂的S期和G2/M期有显著抑制作用;小鼠皮下注射环丙沙星,用SRBC免疫时,特异性抗体增加,但Forxgern等、Sato等却认为该药抑制免疫球蛋白的产生,不过,当小鼠连续3d按10mg/(kg·d)腹腔注射该药,最后一次给药后,接种SRBC免疫,溶血IgG形成细胞受到抑制,IgM形成细胞不变,连续7d给药,抗体形成细胞不再发生变化,若先用SRBC免疫后24h,再连续腹腔给药3d,IgM形成细胞显著增加,IgG则受到抑制。总之,由于方法和条件不同,对环丙沙星免疫调节作用研究常得到一些不同结论;且大多数研究建立在小鼠模型上和体外研究,与兽医临床相比,尚有差距。因此研究该药临床用药状况下的免疫调节作用,有着更实际的意义。链球菌病是常见的热性传染病,链球菌的某些毒力因子对影响宿主吞噬细胞功能、DTH反应、体外淋巴细胞增殖、免疫球蛋白的产生、补体活性的影响已有报道。这些研究主要立足于人链球菌病及体外试验,对抗生素治疗链球菌病免疫学研究报道尚少见诸文献。本研究旨在检测环丙沙星治疗链球菌病时对机体免疫反应的调节作用,以探讨药物、机体与病原间的关系。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物分组及免疫7周龄长大杂交猪24头,体重(25.5±1.4)kg,公母各半,均去势,购于华中农业大学试验种猪场。随机均分为空白组、阴性组、阳性组和试验组。供试前,按生产要求进行饲养,且免疫接种猪瘟、仔猪副伤寒、猪丹毒、猪肺疫等疫苗,不接种链球菌疫苗,无链球菌病史,确保动物没接触过喹诺酮类药物。临试前,在试验条件下观察1周,临床健康,观察和试验期间,饲喂不含任何抗菌药物全价中猪料,圈养,自由饮水。1.1.2药物、药物及试剂供试菌种C55126系马腺疫链球菌兽疫亚种,购于中国兽药监察所。使用前经普通肉汤培养,小白鼠传5代,分离培养,扩大培养,最后用无菌生理盐水稀释成150亿个菌/ml。1.1.3乳酸环丙沙星注射液组环丙沙星,批号990312,中国浙江京新制药厂产品,配成2.5%(W/V)乳酸环丙沙星注射剂(pH4.5～5.5)。按药典要求过滤、分装、灭菌、去热原。1.1.4完全rpmi170培养基硝基蓝四氮唑(NBT)(前进试剂厂生产);噻唑蓝(MTT)(Fluka生产);猪标准IgG(Sigma生产);植物血凝素(PHA)(上海伊华临床医学科技公司生产);RPMI1640(GIBCO生产),临用前在RPMI1640培养液中,加入10%灭活小牛血清、50μmol/L2-巯基乙醇,20～25mmol/L的Hepes、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素,即为完全RPMI1640培养基;淋巴细胞分离液(上海试剂工厂生产)。1.2方法1.2.1共感染试验组和阴性组每头猪按每公斤体重4.5亿个菌于腹部皮下接种,复制猪链球菌病亚急性模型。空白组和阳性组用无菌生理盐水接种。1.2.2给药伤口试验组和阳性组接种后第7天起猪由耳静脉5mg/kgbw注药,2次/d,连续8d;阴性组和空白组,推注无菌生理盐水。1.2.3血清学检测接种第0、7、14、21、28天,前腔静脉无菌采2份血,其一用肝素抗凝,用于血细胞计数、分离淋巴细胞及嗜中性白细胞,另一份不抗凝,用于分离血清供IgG浓度和补体总活性的测定。1.2.4白细胞计数和分类计数显微镜计数法计数白细胞总数,姬姆萨染色法作白细胞分类计数按文献进行。1.2.5还原nbt的能力按文献分离嗜中性白细胞,调整为每毫升3.5×107个细胞,按文献检测其还原NBT的能力,以还原产物溶于二甲亚砜后在540nm处的光密度OD540代表。1.2.6细胞转化能力测定按文献分离淋巴细胞,用完全RPMI1640调整为每毫升3.5×106个细胞,按文献在96孔培养板上,设PHA刺激孔和对照孔,进行淋巴细胞转化试验。以PHA刺激指数(SI)代表淋巴细胞转化能力。其中,SI=PHA刺激孔OD570nm均值/对照孔OD570nm均值。1.2.7dh反应临试第0、7、14、21、28天,按文献进行PHA皮肤试验,以红斑长、短径均值代表DTH反应。1.2.8血清中igg含量的测定按文献进行。1.2.9血清中补体总活性的测定按50%溶血试验计算出每毫升未稀释的血清中所含的50%溶血剂量数(CH50),即补体总活性。1.2.1感染两因素交互效应用SAS软件检测注射环丙沙星和链球菌感染两因素交互效应显著性,用t检验比较试验组、阴性组、阳性组与空白组之间的差异,及试验组与阴性组之间的差异。2结果与分析2.12.2对免疫组化的影响接种后第14、21天,阴性组嗜中性白细胞百分含量极显著低于空白组(P<0.01);试验组接种后第21、28天,显著低于空白组(P<0.05),且极显著低于阴性组(P<0.01),第21天,两因素交互作用显著(P<0.05)。淋巴细胞百分含量则相反,阴性组接种后第14、21天极显著高于空白组(P<0.01);试验组接种后第21天极显著高于空白组(P<0.01),第28天显著高于空白组(P<0.05),且均显著高于阴性组(P<0.05);第21天两因素交互作用显著(P<0.05)。2.32.42.52.62.73开皮尔斯克氏体对抗体作用的影响成功复制出典型的猪链球菌病亚急性模型是本研究的前提。与文献相比,本研究动物感染后体温升高的程度稍低,可能是菌株和动物不同所致,其它如临床症状、血液学变化、病理特征、病原检查(结果未全显示)与文献一致。试验组和阴性组白细胞总数升高,与文献一致。试验组接种后第21天,白细胞总数回落,第28天,药物作用和两因素交互作用才表现出来,且阳性组白细胞总数没有变化,说明试验组白细胞变化主要是链球菌作用导致,环丙沙星本身对机体白细胞总数不影响,而是通过给药后,机体本身损伤得以恢复后,使试验组白细胞数在第21、28天回落,与Jimenez-valera等报道的环丙沙星能降低外周血中白细胞数不一致,可能是试验对象和给药途径不同所致。试验组,因环丙沙星治疗作用以及环丙沙星促进淋巴细胞增殖使其于接种后第21天,淋巴细胞百分含量升高,嗜中性白细胞百分含量相对较低。链球菌感染和环丙沙星均使嗜中性白细胞吞噬功能增强,即还原NBT能力增强。因细菌感染,嗜中性白细胞吞噬功能增强,己糖旁路途径糖代谢增强,葡萄糖酵解中间产物6-磷酸葡萄糖在这个途径氧化脱氢加强,所脱的氢被细胞吞噬的NBT染料接受,从而还原NBT的能力增强;环丙沙星加强己糖旁路途径糖代谢已为文献证实。感染后,链球菌产生某些毒力因子使淋巴细胞转化能力下降,但环丙沙星具有促进淋巴细胞DNA复制的能力,因此,阳性组在第14、28天淋巴细胞转化能力增强,试验组第28天在环丙沙星作用下,链球菌毒力因子的产生和作用降低,环丙沙星促进淋巴细胞DNA复制的能力得以表现,故淋巴细胞转化增强。阴性组于接种第21天,DTH降低,可能与链球菌膜蛋白和溶血素有关,因这两者均能抑制白细胞移行,而白细胞移行抑制试验是体外检测DTH的试验;阳性组接种后第14天,事实这一天还在用药,在药物刺激下,淋巴细胞增殖大大加强,此时药物促进淋巴细胞增殖作用比抑制其生长更强,所以DTH反应比较强,但因环丙沙星在促进细胞DNA复制的同时,还能导致细胞DNA链断裂,且在低浓度时,这种作用更为敏感,所以在第21、28天DTH反应降低;在试验组,环丙沙星杀灭链球菌,阻止其释放毒力因子的同时,自身也丧失了生物活性,因此,淋巴细胞在受到药物刺激后,增殖能力增强,因体内细菌及其毒力因子少,环丙沙星本身也不使其DNA断裂,所以有活力的淋巴细胞数增多,DTH反应增强,即在第21天极显著增高。链球菌侵袭机体,机体产生相应抗体,最初主要是IgM,因此,阴性组和试验组接种后第7天,IgG含量低,但第2周时达到抗体高峰,此时为IgG,所以阴性组第14天IgG含量极显著升高。阳性组于第14、21天,IgG水平低,试验组于第14天,IgG也很低,且低于阴性组,这与环丙沙星对IgG的合成具有抑制作用的报道一致。链球菌感染,体内产生抗原抗体复合物,可固定补体,使阴性组和试验组接种后第7天,补体活性下降,当然,也可能是链球菌荚膜抑制了补体激活途径所致。阳性组接种后第14天,因环丙沙星作用血清中IgG水平较低,而补体活化需要IgG参与,因此此时阳性组补体活性极显著降低;试验组IgG水平相对较高,补体活性与空白组无差异;第21天,虽然阳性组IgG仍然很低,但因环丙沙星使淋巴细胞DNA断裂形成DNA片段,而双链DNA片段是补体经典途径激活剂,故此时阳性组补体活性显著升高;正因如此,试验组第28天显著高于阴性组。总之,环丙沙星在作用于病原的同时,也增强机体的细胞免疫功能和补体总活性,却对IgG合成有抑制作用。从而进一步揭示了链球菌、机体和环丙沙星三者之间的关系提供试验依据,并为制订环丙沙星的用药方案提供参考。阴性组和试验组猪出现了典型亚急性链球菌病症状。接种后1d,体温平均升高1℃,3d后,体温升高一直维持在0.5℃左右,发病动物精神萎糜,食欲不振,接种后第5天,大多数猪大便偏干,个别严重便秘或后期严重腹泻,咳嗽,喘息,有脓性或浆液性分泌物,角膜潮红,后期个别猪眼角有脓性分泌物,病猪关节肿胀、跛行,甚至站立不稳,后肢拖地。病原检查为链球菌。试验组给药后好转,阴性组于接种后第28天1头猪死亡。阳性组和空白组临床表现健康。接种后,阴性组白细胞总数于第7天显著高于空白组(P<0.05),其后极显著升高(P<0.01),试验组猪于接种后第7、14天,白细胞总数显著高于空白组(P<0.01),第21天恢复正常(P>0.05),虽然第28天仍高于空白组(P<0.01),但显著低于阴性组(P<0.05),此时,给药和感染两因素的交互作用显著(P<0.05)。阳性组的白细胞数与空白组无显著差异(P>0.05)。感染和给药两因素均使嗜中性白细胞还原NBT的能力增强(表1),接种后第14、21、28天两因素交互作用极显著(P<0.01)。链球菌感染导致淋巴细胞转化能力降低,注射环丙沙星却增强淋巴细胞转化(表2),阳性组第21天PHA刺激的SI极显著增加(P<0.01),试验组的SI第28天却恢复正常(P>0.05),接种后第14天两因素的交互作