茯砖茶中真菌的分离与测定

茯砖茶中真菌的分离与测定

福庄茶是老茶科的一种高质量品种。据《明史茶法》记载，大约1524年前，椰子茶被认为是中国西北少数民族所需要的官方茶。茯砖茶与绿茶、红茶比较,绿茶属非发酵茶,红茶属半发酵茶,而茯砖茶属于完全发酵茶,其加工工艺独特,独具菌花香。传统的特制茯砖茶已有500年的生产历史;茯砖茶呈金黄色颗粒(俗称“金花”),经中外科学家分析鉴定,具有极强地分解油腻、消食、调节人体脂肪代谢的功能,特别适应于饮食结构中以奶肉类为主的人们饮用。湖南省益阳茶厂有限公司生产的“湘益”牌系列产品质量稳定可靠、品质优良,在国内同行业中处于领先地位。“湘益”牌系列茯砖茶是具有浓郁地方特色的黑茶种类之一,是选用优质茶叶为原料,经科学配方、精制加工而成。其外形整齐如砖片,内质金花普茂,菌香浓郁,开汤后汤色红浓、滋味醇厚、香气纯正,具有消食健胃的显著效果,深受新疆、青海、甘肃、西藏等省、自治区广大消费者的喜爱。为促进“湘益”牌系列茯砖茶发酵关键技术的突破,本研究选用金湘益(“湘益”牌系列产品之一)特制礼品茯砖茶就其微生物种类进行鉴定研究,以期为益阳黑茶发酵关键技术控制奠定坚实的基础。1材料和方法1.1培养基培养基2007年产金湘益特制礼品茯砖茶,采用平板梯度稀释法分离获得的真菌。培养基:改良PDA培养基(加1%茶汁)、查氏培养基、麦芽汁培养基、查氏酵母膏培养基、20%蔗糖查氏培养基、40%蔗糖麦芽汁培养基。主要仪器:微型植物粉碎机、超净工作台、电热恒温培养箱、冰箱、数码显微镜、电子天平、高压灭菌锅等。1.2方法1.2.1真菌本构模型的建立用电子天平准确称取1.0000g金湘益特制礼品茯砖茶100目过筛粉碎样品,定容至10mL,配成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5各10mL,取10-3、10-4、10-5等3个梯度各0.5mL用改良PDA培养基涂布平板,超净台上吹干,将平板置于25℃培养7d,每个梯度重复3次,统计其出现真菌类型和数目,挑取不同类型的真菌单菌落于改良PDA培养基平板划线分离纯化,斜面管4℃保存,用于分子鉴定和形态学鉴定。每克茶样真菌数目计算公式为:N=(菌落数÷稀释倍数)×20。1.2.2同源序列搜索和保藏采用18SrDNA通用引物,用PCR方法获得18SrDNA片段后进行测序(由上海英骏生物技术有限公司完成),将得到的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索,找出对应菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。1.2.3菌落特征测定平板上菌落形态观察运用点植法,将接种针经火焰灭菌并待冷却后,从斜面上挑取少量菌体,接种于相应平板的中间位置,将平板置于25℃培养7~14d,观察菌落特征。1.2.4微结构特征的评价用解剖针从培养皿的菌落上挑取少量菌体,置载玻片的水滴中,加盖盖玻片,于显微镜下观察其形态特征。1.2.5真菌聚类分析2结果与分析2.1金湘益质饼干的纯度用改良PDA培养基涂布平板25℃培养7d,发现其出现真菌类型主要有5种,编号分别为2301、2401、3302、4304、5402(以这5个编号作为相应的菌株编号),对其进行计数统计,同时分别挑取这5种代表性菌落进行纯培养用于后续的分子和形态学鉴定试验。由表1可知,5402型真菌为金湘益特制礼品茯砖茶的优势真菌,每克茶样中数目达4.98×106个,2301、2401、3302、4304型真菌为非优势真菌,较5402相差较明显。由于2301、2401、3302、4304类型出现菌落数目较少,用平板梯度稀释法分离计数具有很大的误差,但这些类型的菌落存在数量是相当可观的,说明它们在黑茶发酵中的作用和地位是不容忽视的,因此,我们对其进行分子和形态学鉴定研究,以便进一步了解黑茶发酵中的微生物作用。2.2菌株情况mglabum获得18SrDNA片段后进行测序,将得到的碱基序列通过因特网在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索,比对结果如下:菌株2301与产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)及疣孢青霉(Penicilliumverruculosum)具有最高同源性,达99.9%;菌株2401与光孢青霉(Penicilliumglabrum)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、爪哇正青霉(Eupenicilliumjavanicum)及E-upenicilliumlimosum具有最高同源性,达99.9%;菌株3302与Paecilomycespascua、Sagenomellaqriseoviridis、多变拟青霉(Paecilomycesvariotii)、Byssochlamyszollorniae、黄丝衣霉(Byssochlamysfulva)、Penicilliumpurpurogenum及青霉(Penicilliumsp.)具有最高同源性,达99.9%;菌株4304与黄曲霉(Aspergillusflavus)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)及酱油曲霉(Aspergillussojae)具有最高同源性,达100.0%;菌株5402与蜡叶散囊菌(Eurotiumherbariorum)、赤散囊菌(Eurotiumrubrum)及灰绿曲霉(Aspergillusglaucus)具有最高同源性,达99.8%。2.3培养基和菌株的形态菌株2301在查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径约1.3cm,平坦有几道同心环纹,质地绒状,培养12d,分生孢子结构大量产生,分生孢子面暗灰绿色,菌丝体橘黄色,反面橘红色,可溶性色素类似较淡的反面颜色且显著突出(图1)。在麦芽汁琼脂平板上菌落培养7d,直径约3.0cm,平坦,有放射状短纹,质地绒状或兼有轻微絮状,分生孢子结构大量产生,分生孢子面暗蓝绿色,菌丝体淡黄色,反面红褐色(图1)。在查氏酵母膏琼脂平板上菌落培养7d,直径约1.8cm,平坦,中心有脐状突起而其他部位平坦,质地绒状,分生孢子结构大量产生,分生孢子面暗灰绿色,菌丝体淡黄色,反面暗红色(图1)。菌株2401在查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径约2.0cm,中间有脐状突起,有沟纹,质地呈显著的绒状,分生孢子面蓝绿色,菌丝体微黄色,反面黄褐色,可溶性色素显著,类似反面稍淡的颜色(图2)。在麦芽汁琼脂平板上菌落培养7d,直径3.5~4.5cm,有少量放射状皱纹,质地绒状或兼有轻微絮状,分生孢子面带微灰蓝绿色,在中部面近淡灰橄榄色,反面带红褐色(图2)。在查氏酵母膏琼脂平板上菌落培养7d,直径2.5~3.0cm,质地绒状或兼有轻微絮状,分生孢子面微灰淡蓝绿色,菌丝体微黄色,反面黄褐色,可溶性色素淡黄色(图2)。菌株3302在查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径2.5~3.0cm,平坦,质地绒状兼轻微絮状,分生孢子结构较多,分生孢子面暗绿色,菌丝体粉色,反面杏黄色(图3)。在查氏酵母膏平板琼脂上菌落培养7d,直径2.0~3.0cm,平坦,质地绒状兼絮状,分生孢子结构较多,分生孢子面灰绿色,反面橘黄色(图3)。在20%蔗糖查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径1.5~3.0cm,平坦,质地绒状兼絮状,分生孢子结构灰绿色,有白色菌丝环绕,反面浅绿色(图3)。菌株4304在查氏琼脂上菌落培养7d,直径约3.5cm,质地丝绒状,中部稍现絮状,具不明显的沟纹,颜色初为黄绿色,而后变深,菌落反面微褐色,老化后产黄绿色色素(图4)。在麦芽汁琼脂平板上菌落培养7d,直径约6.0cm,质地丝绒状,絮状,暗草绿色,反面无色(图4)。在查氏酵母膏琼脂平板上菌落培养7d,直径约5.0cm,质地丝绒状,中部有气生菌丝,具辐射状的沟纹,颜色为草绿色,反面无色至粉红色(图4)。菌株5402在查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径0.5~1.2cm,平坦,分生孢子结构少,灰绿色,闭囊壳较多,黄色,反面棕褐色,产黑褐色色素(图5)。在20%蔗糖查氏琼脂平板上菌落培养7d,直径约2.0cm,平坦或具皱纹,黄褐色,分生孢子结构灰绿色,闭囊壳大量形成,有橙褐色菌丝环绕,反面棕黄色(图5)。在40%蔗糖麦芽汁琼脂平板上菌落生长迅速,培养7d,直径约5.0cm,气生菌丝明显,分生孢子结构较多,呈灰绿色,反面带橙褐色(图5)。2.4枝、梗、茎、根菌株2301:分生孢子梗茎(80.0~250.0)μm×(2.5~3.2)μm,短平滑,顶端通常膨大;帚状枝双轮生,偶有三轮生或单轮生,彼此紧贴而近于平行;梗茎每轮4~8个,(9.0~13.0)μm×(2.5~3.0)μm;瓶梗每轮4~6个,披针形,梗颈明显;分生孢子呈现椭圆形,充分成熟时部分呈现近球形,(2.8~3.5)μm×(2.2~3.0)μm,壁平滑(图6)。菌株2401:帚状枝三轮生,少量双轮生,彼此稍叉开或叉开;副枝1~2个,(12.0~20.0)μm×(2.5~3.4)μm;梗基每轮2~5个,(10.0~13.0)μm×(2.5~3.0)μm;瓶梗每轮4~8个,(7.0~9.0)μm×(2.0~2.5)μm,瓶状;分生孢子呈现椭圆形或近球形,(3.0~3.5)μm×(2.5~3.0)μm,壁平滑(图6)。菌株3302:帚状枝双轮生,偶有三轮生或单轮生,彼此通常稍叉开,也有紧贴近于平行者;梗基每轮5~9个,(9.0~14.0)μm×(2.0~2.7)μm;瓶梗每轮4~8个,(8.0~12.0)μm×(1.0~2.5)μm,披针形,梗颈短;分生孢子呈现球形或近球形,2.5~3.5μm,呈小疣状粗糙(图6)。菌株4304:分生孢子幼时为球形,后成辐射形,分生孢子梗茎(140.0~700.0)μm×(4.8~11.0)μm,壁近于光滑或有时在顶囊处现粗糙,顶囊近球形,小者棒形,13~41μm,产孢结构单层,分生孢子球形或近球形,4.2~6.0μm,具粗疏小刺(图6)。菌株5402:闭囊壳球形或近球形,12~16μm,子囊孢子双凸镜形,(6~8)μm×(4~6)μm,“赤道”部分具明显但较浅的沟,两侧有脊,凸面光滑(图6)。2.5聚类结果分析对获得的5株菌株的18SrDNA序列进行聚类分析,结果表明它们与优势菌的种间有一定差异(图7)。3菌株形态特征和聚类分析结合18SrDNA片段的序列和形态学鉴定结果,经广东省微生物分析检测中心鉴定(粤微检(2009)ZD0398号)确认:菌株2301的18SrDNA序列与Penicilliumpurpurogenum同源性高达99.9%,其形态特征与Penicilliumpurpurogenum最相似。菌株2401的18SrDNA序列与Penicilliumchrysogenum同源性高达99.9%,其形态特征与Penicilliumchrysogenum最相似。菌株3302的18SrDNA序列与Penicilliumsp.同源性高达99.9%,其形态特征与Penicilliumsp.最相似。菌株4304的18SrDNA序列与Aspergillussojae同源性高达100.0%;其形态特征与Aspergillussojae最相似。菌株5402的18SrDNA序列与Eurotiumherbariorum同源性高达99.8%,其形态特征与Eurotiumherbariorum最相似。本研究采用改良PDA培养基,对2007年产金湘益特制礼品茯砖茶,采用平板梯度稀释法分离获得的真菌2301、2401、3302、4304、5402,运用分子和形态学鉴定相结合的方法对其进行了种的鉴定。首先,从中分离的优势菌经我们鉴定为蜡叶散囊菌,与传统认为的冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)有差异,可能是由于我们对优势菌的挑取只是随机选择一个单菌落,而蜡叶散囊菌和冠突散囊菌属于相近的真菌种,Eurotiumcristatum18SrDNA登录号AB002073.1,与Eurotiumherbariorum18SrDNA相似度为99%,我们重复了培养结果,与湖南农业大学分离的冠突散囊菌生长比较,在PDA培养基上生长的菌落形态特征基本上不能区分,故有可能存在较大的误差。当然,也有可能是不同茯砖茶种类中,其优势菌本身就存在差异,是散囊菌的生理小种或变异种,这有待进一步的研究。由于不同茯砖茶种类中优势菌存在差异,说明很有必要对不同茯砖茶种类进行比较研究,建立黑茶优势菌种质资源库,以期更好地提升黑茶品质,发挥黑茶应有的作用。另外,我们用平板梯度稀释法也分离到了2301、2401、3302、4304