卷柏化学成分研究

卷柏化学成分研究

兖州柏树是柏树科的一种全草。主治急性黄疸型肝炎、肝硬化腹水、咳喘、肺炎、咳血崩漏;外用治烫火伤、狂犬咬伤及外伤出血。民间对治疗乙型肝炎、肝癌和肺炎具有一定疗效。该科植物中含有多种黄酮类、生物碱类、酚类、有机酸类及糖类化合物,目前尚未见对兖州卷柏成分系统研究的文献报道。本文从石油醚和乙酸乙酯部位分离得到7个化合物,其结构分别鉴定为正十六烷酸(1),正十八烷酸(2),β-谷甾醇(3),豆甾醇(4),穗花杉双黄酮(5)和β-D-glucopyranoside,(3β)-cholest-5-en-3yl(6),β-香树脂醇(7)。此外本试验针对兖州卷柏抗肺炎、肝炎的疗效,对化合物5、6和7的体外抗菌活性进行了研究。寻找兖州卷柏抗肺炎和肝炎的化学物质基础。1实验部分1.1合成矿物的表征PESystem2000FTIR型红外光谱仪;WPS-1型数字熔点仪;Bruker-500MHz型核磁共振仪;Vario-EL-Ⅲ型元素分析仪;VGAUTOSpec-3000型质谱仪;层析硅胶、GF254硅胶薄层板(青岛海洋化工厂);SephadexLH-20(Pharmacia)。兖州卷柏于2007年8月采于广西,经中南大学化学化工学院刘向前教授鉴定为兖州卷柏(SelaginellainvolvensSpring.)。样品存放于中南大学化学化工学院标本室。1.2化合物3和4的合成兖州卷柏干燥全草8kg,粉碎,70%乙醇冷浸提取三次,过滤,60℃下减压回收溶剂,得浸膏316g,用热水悬浮,减压过滤,滤饼依次用石油醚(A部分65g),乙酸乙酯(B部分88g)萃取。将A部分经硅胶柱色谱层析,石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,经薄层分析合并馏分后得5个组分,将组分Ⅲ用反复硅胶柱层析得到化合1(35mg)和2(43mg);将组分Ⅳ用反复硅胶柱层析得到化合物3和4(65mg)。将B部分硅胶柱层析,氯仿-甲醇梯度洗脱,经薄层分析合并馏分后得6个组分,对组分Ⅲ进行反复硅胶柱层析(氯仿:甲醇=15:1洗脱),在馏分65~70中析出橙黄色粉末5(82mg);对组分Ⅴ进行反复硅胶和SephadexLH-20色谱柱层析,得到6(38mg)和7(32mg)。1.3最低抑菌浓度mic测定在含有浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016mg/mL药物5、6、7和对照药品环丙沙星(CP)的肉膏琼脂平板培养基上,分别接种肺炎链球菌(S.penumonniae,Sp)、金黄色葡萄球菌(S.aureus,Sa)、大肠杆菌(E.coli,Ec)、绿脓杆菌(P.aeruginose,Pa),放入37℃孵箱内培养24h取出,观察不同细菌在不同浓度的药物平板上的生长情况,测量出药物对细菌的最低抑菌浓度MIC。如表1所示:5对肺炎链球菌和绿脓杆菌具有强的抑菌活性;6对肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌具有强的抑菌活性。7对肺炎链球菌和大肠杆菌具有强的抑菌活性。2相对分子质量化合物1白色片状固体,mp.62~63℃,ESI-MSm/z:257[M+H]+,分子式为C16H32O2。1HNMR(CDCl3,500MHz):δ0.89(3H,t,J=7.0Hz),1.63(2H,m),2.36(2H,t,J=7.5Hz),1.28(24H,m)。13CNMR(CDCl3,125MHz)δ:14.12(C-CH3),22.71(C-15),24.73(C-14),29.02(C-13),29.33(C-12),29.43(C-11),29.54(C-10),29.61(C-9),29.72(C-4~8),31.93(C-3),34.01(C-2),179.62(COOH)。根据以上光谱数据判断该化合物为正十六烷酸(hexadecanoicacid)。化合物2白色叶片状固体,mp.67~68℃,红外光谱中IRνΚBrmaxKBrmaxcm-1:2919,2851(-CH3),1703(C=O)。1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:0.90(3H,t,J=7.0Hz),1.66(2H,m),2.37(2H,t,J=7.5Hz),1.28~1.32(30H,m);13CNMR(CDCl3,125MHz)δ:14.14(C-CH3),22.74(C-17),24.73(C-16),29.10(C-15),29.25(C-14),29.43(C-6~13),29.62(C-5),29.73(C-4),31.92(C-3),33.80(C-2),178.81(COOH)。根据以上光谱数据判断该化合物为正十八烷酸(stearicacid)。化合物3/43和4为混合物,一起分离得到。白色针状结晶,ESI-MSm/z:415.4[M+H]+,413.5[M+H]+,给出2个相对分子质量分别为414和412;1HNMR(CDCl3,500MHz)δ:5.32(1H,d,J=5.2,2.0Hz),5.14(1H,dd,J=15.1,8.5Hz),5.10(1H,dd,J=15.1,8.5Hz),3.50(2H,m),0.66~1.01成对出现12个甲基;结合1HNMR和EI-MS数据,推测该化合物可能为β-谷甾醇和豆甾醇的混合物。将该混合物分别与β-谷甾醇,豆甾醇的标准品共TLC对照,Rf值一致,因此确定该混合物为β-谷甾醇(β-sitosterol)和豆甾醇(stigmasterol)。化合物5橙黄色粉末,mp.284~286℃,HCl-Mg粉反应为阳性,FeCl3试液显色为浅蓝色。UVλΜeΟΗmaxMeOHmax:197,270,340nm;ESI-MSm/z:537[M-H]+,538[M]+,结合1HNMR及13CNMR推断分子式为C30H18O10。IRνΚBrmaxKBrmax:3400,2916,2837,1653,1609,1573,1360,1285,1024,839cm-1。1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ:6.46(1H,d,J=2.4Hz,H-8),6.21(1H,d,J=2.4Hz,H-6),6.42(1H,s,H-6″),7.58(2H,d,J=8.8Hz,H-2″′,H-6″′),6.73(2H,d,J=8.8Hz,H-5″′,H-3″′),6.86(1H,s,H-3),6.81(1H,s,H-3″),8.02,8.03(2H,m,H-2′,H-6′),7.15(1H,d,J=9.2Hz,H-5′);13CNMR(DMSO-d6,125MHz)δ:163.92(C-2),103.21(C-3),182.10(C-4),161.10(C-5),98.55(C-6),164.03(C-7),94.02(C-8),156.72(C-9),103.81(C-10),120.92(C-1′),127.62(C-2′),120.15(C-3′),159.17(C-4′),116.09(C-5′),131.14(C-6′),163.90(C-2″),102.20(C-3″),181.05(C-4″),160.56(C-5″),98.64(C-6″),161.11(C-7″),104.26(C-8″),154.51(C-9″),103.64(C-10″),121.30(C-1″′),128.23(C-2″′),115.91(C-3″′),160.92(C-4″′),115.80(C-5″′),128.21(C-6″′)。以上光谱数据与文献值基本一致,判断该化合物为穗花杉双黄酮(amentoflavone)。化合物6白色粉末,mp.291~292℃,硫酸乙醇显紫红色。根据ESI-MSm/z:549[M+H]+,以及元素分析推测该化合物化学式为C33H56O6,1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ:0.65(3H,s,Me-18),0.96(3H,s,Me-19),0.83(3H,d,J=6.5Hz,Me-21),0.91(3H,d,J=6.5Hz,Me-26),0.81(3H,d,J=6.5Hz,Me-27)显示有5个甲基质子信号,推断为甾体类化合物。13CNMRδ:140.35,121.11及1HNMRδ:5.33(1H,brs),显示母核在C-5和C-6有C=C结构。根据IRνΚBrmaxKBrmax:3500(OH)cm-1,以及13CNMRδ:101.27,1HNMRδ:4.23(1H,d,J=7.5Hz),判断母核C-3上连有糖苷基。HSQC谱显示在1HNMR谱中δ:4.90,4.89,4.86,4.44为4个羟基活泼氢;HSQC谱中C(δ121.11)与H(δ5.33),C(δ76.82)与H(δ3.46),C(δ101.27)与H(δ4.23),C(δ73.37)与H(δ2.89),C(δ76.67)与H(δ3.12),C(δ76.65)与H(δ3.02),C(δ70.00)与H(δ3.06),C(δ61.00)与H(δ3.64,δ3.40);1H-1HCOSY谱中H(δ4.23)与H(δ2.89),H(δ2.89)与H(δ3.12,δ4.89),H(δ3.12)与H(δ3.02,δ4.90),H(δ3.02)与H(δ3.06,δ4.86),H(δ3.06)与H(δ3.40)相关,由此可以确定配糖基为β-D-glucopyranoside.1HNMR和13CNMR数据为1HNMRδ:3.46(1H,m,H-3),4.23(1H,d,J=7.5Hz,H-1′),2.89(1H,dd,J=8.0,5.5Hz,H-2′),3.12(1H,m,H-3′),3.02(1H,dd,J=5.5,9.0Hz,H-4′),3.06(1H,m,H-5′),3.64(1H,ddd,J=11.5,5.5,2Hz,H-6α′),3.40(1H,dd,J=11.5,9.0Hz,H-6β′);13CNMR76.82(C-3),101.27(C-1′),73.37(C-2′),76.67(C-3′),76.65(C-4′),70.00(C-5′),61.00(C-6′)。并对照文献,判断该化合物为β-D-glucopyranoside,(3β)-cholest-5-en-3yl.化合物7白色粉末,mp.197~199℃,Liebermann-Burchard反应呈阳性,ESI-MSm/z:449.4[M+Na]+,427.4[M+H]+,结合1H、13CNMR确定其分子式为C30H50O。IRνΚBrmaxKBrmaxcm-1:3394(OH),2922,2852,1469,1383(CH3);1HNMR(DMSO-d6,500MHz)δ:0.72、0.91、0.95、0.97、1.00、1.04、1.07、1.10(3H,s),分别为8个甲基质子信号,δ3.24(1H,dd,J=5.2,10.9Hz,H-3),δ5.20(1H,brs,H-12)。13CNMR谱中(DMSO-d6,125MHz),共给出30个碳信号,其中δ142.24和δ121.76为一对