卷柏药材穗花杉双黄酮的快速含量分析方法

卷柏药材穗花杉双黄酮的快速含量分析方法

柏树广泛分布，世界上7000多种植物，中国有70多种。中国药典2005年版一部收载了卷柏Selaginellatamariscina(Beauv.)Spring和垫状卷柏S.pulvinata(Hook.EtGrev.)Maxim2个品种。现代药理研究表明,卷柏属植物不仅具有传统的消炎解毒作用,而且具有降血压、降血糖、抗菌、抗病毒、增强免疫功能和抑制氧化应激等作用。卷柏属化学成分主要为以穗花杉双黄酮(amentoflavone)为主的双黄酮类化合物,自1971年MasayoshiOkigawa等从卷柏中分出穗花杉双黄酮以来,相继有50余种双黄酮类成分从本属分离得到,其中均含有穗花杉双黄酮,且含量最高。穗花杉双黄酮具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、血管舒张作用等生理活性,是卷柏类药材的特征性成分,本文建立一种快速有效的穗花杉双黄酮分析方法,比较不同产地、不同品种卷柏药材的含量分布,从而为卷柏药材的质量控制提供理论依据,并为优良品种的筛选奠定基础。1药物、药品与试药Agilent1100型高效液相色谱仪(配备低压四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、ChemStations色谱工作站,美国安捷伦科技有限公司);UVProbe-2450紫外可见分光光度仪(日本岛津公司);BP211D电子天平(0.00001g,德国塞多利斯公司)。穗花杉双黄酮(amentoflavone)对照品(自制,UV、IR、H1NMR、C13NMR鉴定结构,经HPLC检测,归一化法计算纯度>99.0%)。乙腈为色谱纯,水为纯净水并经0.45μm水系滤膜过滤,其余试剂均为分析纯。垫状卷柏药材(2004年购于湖南邵阳廉桥药材市场),卷柏药材(湖南省九芝堂药材公司,详见表2),经本院李劲平副教授分别鉴定为S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim.和S.tamariscina(Beauv.)Spring;卷柏和垫状卷柏对照药材(中国药品生物制品检定所,批号分别为121116-200503、121104-100301)。2方法和结果2.1流动相、色谱线温度本实验采用色谱柱为日本岛津公司VP-ODS柱(4.6mm×250mm,5μm),流动相为乙腈-0.2%醋酸水溶液,梯度洗脱(ACN%:0min25%,20min30%),流速为1.2mL·min-1,检测波长为338nm,柱温为30℃,进样10μL。2.2对照品穗花杉双黄酮以及供试品色谱图在上述色谱条件下,穗花杉双黄酮色谱峰理论塔板数>105,对称因子为1.10,与相邻杂质峰的分离度>1.5。对照品穗花杉双黄酮以及供试品色谱图见图1。A.穗花杉双黄酮色谱图(chromatogramofamentoflavone);B.卷柏对照药材供试品色谱图(chromatogramofS.tamariscina);C.垫状卷柏对照药材供试品色谱图(chromatogramofS.pulvinata)2.3超声法提取纤维精密称取穗花杉双黄酮约30.00mg,置100mL容量瓶中,甲醇超声溶解并稀释至刻度,摇匀,经0.45μm微孔滤膜滤过,即得。2.4提取次数的提取精密称取药材粗粉(过20目筛)约20.0g,加甲醇160mL·次-1,回流提取3次,60min·次-1,合并提取液,趁热过滤,减压浓缩,转移至50mL容量瓶中,甲醇稀释至刻度,摇匀,经0.45μm微孔滤膜滤过,即得。2.5线性方程与检测限分别精密量取“2.3”项下的对照品溶液1、2、5、10、20、30μL注入到液相色谱仪,以进样量X(μg)对色谱峰面积Y进行线性回归求得线性方程为:Y=3102X+16.50(r=0.99999),线性范围为0.295～8.853μg。以3倍信噪比(S/N≈3)求得穗花杉双黄酮的检测限为2ng。结果表明:线性范围较宽,检测限低。2.6仪器精密度试验在“2.1”项色谱条件下,对同一份供试品溶液重复进样6次,测得穗花杉双黄酮的峰面积,计算RSD为0.82%,表明仪器精密度良好。取同一份供试品溶液依次在0、2、4、8、12、24、48h测定穗花杉双黄酮的峰面积,计算RSD为0.91%,表明供试品溶液在室温下48h内稳定。取同一批垫状卷柏药材,按“2.4”项下方法平行制备6份,测定穗花杉双黄酮的含量并计算RSD为1.15%,表明该方法的重复性符合含量测定要求。2.7对照品添加溶液取穗花杉双黄酮对照品适量,精密称定,加甲醇制成浓度为0.423mg·mL-1的溶液,作为回收率试验的对照品添加溶液。取同一批已知含量的垫状卷柏药材(amentoflavone:2.176mg·g-1)约10.0g,精密称定,定量加入上述对照品添加溶液50mL,按“2.4”项下制备方法,平行制备6份,测定并计算加样回收率和RSD,结果见表1。2.8样品分析取药材各2份,按“2.4”项下方法和“2.1”项下色谱条件测定峰面积积分值,外标标准曲线法计算含量,结果见表2。3讨论3.1穗花杉双黄酮的提取在提取方法的考察试验中,分别考察了超声与加热回流提取,提取2、3、4次,提取30、60、90min,结果表明回流提取3次,60min·次-1可将穗花杉双黄酮提取完全。3.2检测波长的选择应用二极管阵列检测器在200～400nm对穗花杉双黄酮色谱峰进行扫描:穗花杉双黄酮在338nm处有最大吸收,亦为双黄酮类化合物的特征吸收,故选择338nm作为检测波长。3.3分离度结果分析在洗脱条件的摸索中,首先考察乙腈-0.2%醋酸溶液等度洗脱,结果表明,样品分离度低,峰形拖尾,分离效果不理想。经过反复比较,选择乙腈-0.2%醋酸溶液梯度洗脱条件(ACN%:0min25%,20min30%),达到较满意分离效果。3.4卷柏、垫状卷柏含量由测定结果可以看出,穗花杉双黄酮在不同卷柏药材中的含量存在较大差异,以卷柏含量最高,垫状卷柏含量最低。说明穗花杉双黄酮在药材中的含量分布可能与种属及生长环境有关,本分析方法有望为优良卷柏药材的培育及筛选提供依据。3.5hplc法测定双黄酮类化合物穗花杉双黄酮的表达中国药典2005年版中仅建立了以卷柏对照药材进行薄层定性鉴别的方法,未进行定量控制,文献报道的含量测定方法或测定非特征性成分如腺苷、纤维素酶、海藻糖等,或