卷柏中总黄酮和穗花杉双黄酮的含量测定

卷柏中总黄酮和穗花杉双黄酮的含量测定

柏树是蕨类植物科的一种约700种植物。它分布在世界各地。中国大约有50多个品种，25个品种已经被已知。2010年，中国药店将列出柏树（beauv.）、柏树s.pulma（hook.ethyv.）和柏树s.pulma（hook.ethyv.）的两个品种。贵州有34种植物可用于医药，23种植物可用于药物。除少数品种外，贵州分布广泛。根据现代药理学研究，柏树中存在天然多酚类抗炎剂，具有抗脂质过氧化和自由基去除过程，能显著减少小鼠的消耗速度和消耗，提高耐氧能力，拓宽冠状动脉。改善血流变学指标，对溶解磷脂酰亚胺诱导的血管内皮细胞损伤进行保护。鉴于列入药典的卷柏资源有限,为寻找药用卷柏新资源,本研究对贵州产的5种卷柏中的活性成分总黄酮及主要成分穗花杉双黄酮进行了含量测定.发现薄叶卷柏、深绿卷柏和江南卷柏的总黄酮较垫状卷柏;江南卷柏中穗花杉双黄酮的含量比垫状卷柏的高.1材料、仪器和试药仪器HP1100型高效液相色谱仪(在线脱气机、二元泵、自动进样器、柱温箱、VWD检测器,ChemStation色谱工作站),HP8345紫外分光光度仪(美国惠普);AL-104型电子天平;旋转蒸发仪(BUCHI),KQ-300DA型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).穗花杉双黄酮(批号1617-53-4)购于上海展舒化学科技有限公司(纯度〉98%).卷柏采自贵州省三都县、荔波县等地,经贵州师范大学王培善教授鉴定为垫状卷柏(S.pulvinata(Hook.etGrev.)Maxim);细叶卷柏(S.labordeiHieron.exChrist);深绿卷柏(S.doederleiniiHieron.);薄叶卷柏(S.delicatula(Desv.)Alston.);江南卷柏(S.moellendorfjjHieron).乙腈为色谱纯,水为乐百氏纯净水,其余试剂均为分析纯.2方法和结果2.1单因素试验设计精密称取垫状卷柏药材1.00g,用乙醇提取,根据提取方式、溶剂选择、不同乙醇体积分数、料液比、提取时间及次数等单因素初筛试验结果,分别确定乙醇体积分数(A)、提取次数(B)、提取时间(C)和乙醇倍量(D)为因素,每个因素各取3个水平,因素水平见表1.2.2供试品溶液的制备精密称取垫状卷柏药材27份(分为9组,每组3份),每份1.00g,按L9(34)正交试验表中规定的条件用乙醇进行回流提取,提取液过滤合并,减压回收乙醇,干燥后用甲醇转移定容至100mL,得相应供试品溶液.2.3黄酮的总含量为2.3.1对照溶液的制备精密称取干燥恒重的穗花杉双黄酮对照品5.60mg,置50mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,摇匀,作为对照品溶液.2.3.2试验溶液的制备按“2.2项”制备供试品溶液,取2mL定容50mL,得相应样品的供试品溶液.2.3.3标准曲线的绘制精密吸取2.3.1下的对照品溶液1,1.5,2,2.5,3,3.5,4mL置25mL量瓶,加甲醇至刻度,摇匀.在335nm处测定吸光度.以吸光值为纵坐标(Y),对照品的质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,得回归方程Y=0.053X-0.019(r=0.9999)(n=7),总黄酮在4.481～7.92g/mL内线性范围内良好.2.3.4精密度实验精密吸取同一供试品溶液,重复测定6次吸光度,计算总黄酮的含量,总黄酮含量的RSD为0.33%,结果表明该方法精密度良好.2.3.5总黄酮质量分数精密称取同一份提取物,配制供试品溶液,分别于0,2,4,8,12,24,48h测定吸光度,计算总黄酮的质量分数,结果总黄酮质量分数的RSD为0.59%,说明供试品溶液在48h内稳定性良好.2.3.6加样回收率试验精密称取垫状卷柏样品0.50g,共9份,加入低、中、高浓度的穗花衫双黄酮对照品适量,按供试品溶液制备方法处理,按上述吸收波长测定并计算回收率.结果见表2.2.3.7样品测定精密称取6种提取物,按供试品溶液制备项下方法制备供试液,按上述吸收波长测定,计算质量分数.2.4参考文献中穗花盆的双黄酮2.4.1对照溶液的制备精密称取干燥恒重的穗花杉双黄酮对照品5.60mg,置50mL量瓶中,加甲醇超声溶解,定容至刻度,摇匀,得对照品溶液.2.4.2试验溶液的制备按“2.2项”制备供试品溶液,取2mL加甲醇定容50mL.摇匀,用0.45μm的微孔滤膜滤过,作为供试品溶液.2.4.3%磷酸溶液样品色谱柱为SunFireTM-C18色谱柱(ϕ4.6mm×150mm,5μm);流动相:乙腈-0.20%磷酸水溶液(体积比35∶65),体积流量:1.0mL/min,检测波长:335nm;柱温:30℃;进样量:10μL.2.4.4标准曲线的绘制把“2.4.1”项下的对照品溶液用0.45μm微孔滤膜滤过,分别取1,2,3,4,5,6,7,8mL,定容到25mL,按“2.4.3”项下色谱条件测定,记录峰面积.以峰面积积分值为纵坐标(Y)、对照品的质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,得回归方程Y=28.769X-3.372(r=0.9999),穗花杉双黄酮在4.48～31.36μg/mL范围内与吸光度线性关系良好.2.4.5加样回收和精密度试验精密度实验精密吸取同一供试品溶液10μL,注入高效液相色谱仪,重复测定6次,记录穗花杉双黄酮峰面积,计算得RSD值为1.57%.结果表明该方法精密度良好.2.4.6穗花杉双黄酮峰面积的稳定性精密吸取同一供试品溶液,分别于0,2,4,8,12,24,48h进样10μL,记录峰面积,结果穗花杉双黄酮峰面积的RSD为2.29%.结果表明供试品溶液在48h内稳定.2.4.7加样回收率试验精密称取垫状卷柏样品0.50g,共9份,平均分为3组,以低、中、高三水平浓度梯度分别精密加入对照品,按每一浓度梯度取3份,按供试品溶液制备方法处理,按上述色谱条件测定并计算回收率.结果见表3.2.4.8样品测定精密称取各提取物,按供试品溶液制备项下方法制备供试液,按上述色谱条件测定,由回归方程计算穗花杉双黄酮的含量.2.5各因素主次作用的极差值按照L9(34)正交设计安排试验,结果见表4,方差分析见表5.以总黄酮提取量为考察指标,极差值显示,各因素作用主次自大至小依次为A,B,C,D;方差分析结果表明:A,B,C因素的影响有统计学意义,以A3B3C3D1-3为最佳组合.即药材加75%乙醇回流提取3次,每次3h,料液比(m(g)/V(mL),在1∶8倍至1∶15倍均可.2.6最佳工艺条件的确定精密称取6种干燥的卷柏药材各1.00g,每种3份,加75%乙醇回流提取3次,每次3h,料液比(m(g)/V(mL)=1∶10,重复测定3次取平均值,分别计算总黄酮和穗花杉双黄酮的质量分数,结果见表6.结果表明:用最佳工艺条件提取,垫状卷柏提取物中总黄酮和穗花杉双黄酮的质量分数均高于其他各正交试验值,说明本最佳工艺条件合理,同时也表明此工艺具有较好的稳定性.3讨论3.1提取医疗用品的方法分别考察了水煮、超声、回流等提取方式,以总黄酮为考察指标,结果发现回流提取效果好,因此选用回流方式提取卷柏药材.3.2检测波长的确定在选择色谱条件时针对检测波长的确定采用紫外扫描,发现穗花杉双黄酮的最大吸收波长为210,270nm和335nm,其中335nm处在HPLC图上受杂峰最少,为此选用335nm作为检测波长.3.3样品的洗脱条件选择首先考察甲醇-水,乙腈-水,甲醇-0.20%磷酸溶液,乙腈-0.20%磷酸等梯度洗脱,结果表明,样品分离度低,峰形拖尾,分离效果不理想.经过反复比较,选择乙腈-0.20%磷酸溶液洗脱条件,穗花杉双黄酮峰比较对称,与其周围峰分离度大于4,达到较满意分离效果.3.4黄酮与穗花杉、双黄酮的hplc测定方法的建立及验证由测定结果可以看出,总黄酮、穗花杉双黄酮在不同卷柏药材中的含量存在较大差异,以贵州三都县产江南卷柏含量最高.说明总黄酮、穗花杉双黄酮在药材中的含量分布可能与种