超高效液相色谱法测定藤茶中二氢杨梅素与杨梅素的含量

超高效液相色谱法测定藤茶中二氢杨梅素与杨梅素的含量

1藤茶商品与试剂ultimate3000slc系统，包括hpg-3000ms高压泵、ts-3000ms自动取样器、tcc-3000ms柱温箱、dad-3000ms检测器和变色龙软件（美国dionex公司）。cp225d是1万英尺（德国sunrise公司）。超声波清洗机sd-5200d（宁波新蔡生物科技有限公司，频率：40khz，功率：300w）。藤茶商品购自湖南、广西、福建、湖北、江西和香港等地,共19份。DMY与MY对照品(笔者自制,经紫外、红外、质谱和核磁验证与文献一致,纯度>98%);甲醇、乙醇、石油醚(30~60℃)、丙酮(分析纯,广东光华化学厂有限公司);乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);Milli-Q超纯水(美国Millipore公司);磷酸(色谱纯,美国TEDIA公司)。2方法和结果2.1对色度条件的研究2.1.1对照品检测方法取DMY与MY对照品溶液各适量,在200~400nm波长范围内扫描。结果表明,DMY在290nm、MY在373nm波长处有最大吸收。文献采用双通道双波长分别对对照品进行测定,本试验则首次采用一个通道内波长切换的方法同时进行检测,即前2min检测波长为290nm测定DMY,后2min检测波长为373nm测定MY。试验比较了不同流速下的峰形和分离度,最终确定最佳流速为0.4mL·min-1。2.2混合对照品溶液分别精密称取DMY、MY对照品6.34、1.12mg,置于同一10mL量瓶中,以甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,即得混合对照品母液,稀释10倍后得到混合对照品溶液,4℃保存,备用。2.3提取条件优化为了获得更好的用于定量分析的样品提取方法,笔者对提取溶剂、提取方法、提取溶剂体积、提取时间和提取次数等参数进行了优化。由于藤茶中含有大量叶绿素等脂溶性成分,因此在进行溶剂提取前,先采用石油醚在索氏提取器中进行回流,除去叶绿素等脂溶性成分。2.3.1提取溶剂的确定笔者考察了无水甲醇、无水乙醇和不同浓度的甲醇溶液,通过对DMY与MY的提取率比较,最后确定使用75%甲醇为提取溶剂。提取溶剂考察结果见表1。2.3.2dmy的热稳定性笔者考察了回流提取、超声提取和冷浸提取,结果表明超声和回流提取的效率高于冷浸提取。但回流提取中,MY的提取率明显高于其他2种方法,是否因为DMY在加热过程中转化成了MY?因此在试验中进行了DMY的热稳定性研究(见“2.3.3”项下)。为了保证含量测定过程中各成分的稳定性,最终选择超声提取作为DMY与MY的提取方式。提取方式考察结果见表2。2.3.3dmy与tables-ms的混合成分提取溶液的稳定性DMY为一种弱酸性物质,根据文献报道,由于DMY中含有邻三酚羟基结构,容易被氧化,pH值、温度、金属离子、光线等对DMY均有影响。在进行提取方法考察过程中发现,回流提取中MY的提取率明显高于超声提取与冷浸提取;同时,超声时间过长引起的水温升高对检测结果也有影响。DMY结构中羰基的α位氢比较活泼,在加热条件下,是否很容易脱氢形成具有更稳定共轭结构的MY,或者脱水变成别的物质?为了证明以上猜想,设计了以下试验:称取2.60mgDMY与2.42mgMY,加入100mL75%甲醇超声溶解制成混合液1。采用加热回流的方法,在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h分别取样分析,观察DMY与MY峰面积比的变化。结果表明,随着回流时间的延长,DMY与MY在混合液1中的峰面积比逐渐降低,由最开始的2.6降到0.7(见图1);此外,溶液的颜色也由初始的淡黄色变为红棕色,这可能与DMY含量减少、MY含量上升有关。本课题组还考察了DMY与MY在无水甲醇中回流的稳定性。称取2.78mgDMY与2.40mgMY,加入100mL甲醇超声溶解制成混合液2。采用加热回流的方法,在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h分别取样分析,观察DMY与MY峰面积比的变化。结果表明,随着回流时间的延长,DMY与MY在混合液2中的峰面积比略微有所下降(见图2);同时,溶液的颜色一直保持初始的淡黄色,可见DMY在无水甲醇中的热稳定性较75%甲醇好,DMY在含水溶剂中热稳定性比较差。此外,试验过程中还发现,混合液2在室温放置72h后,样品中DMY的浓度由原来的27.8μg·mL-1下降至24.0μg·mL-1,而MY的浓度由原来的22.8μg·mL-1增加至44.0μg·mL-1。因此,在进行藤茶中DMY与MY含量测定的试验过程中,应控制提取溶液的温度。建议采用超声波短时间提取方法,样品制备好后应避光低温保存,检测时间不超过8h。2.3.4提取温度的确定笔者对不同的提取时间进行了考察,结果表明超声提取20min效果最佳。提取时间考察结果见表3。综上,虽然DMY在无水甲醇中的热稳定性较75%甲醇好,但是考虑到最终采用超声短时间提取,故温度对DMY的提取影响不大,并且75%甲醇提取率最高,所以继续采用75%甲醇作为提取溶剂。最终确定的提取方法:精密称取藤茶粗粉0.2g,置索氏提取器中,加入石油醚(30~60℃)200mL回流至无色,样品挥干石油醚后改用75%甲醇超声提取20min,滤过,滤液转移至25mL量瓶中,以75%甲醇定容,摇匀,经0.22μm微孔滤膜滤过,取滤液作为供试品溶液,备用。2.4方法研究2.4.1系统适用性测试在“2.1.3”项下色谱条件下,DMY、MY与其相邻色谱峰的分离度均>1.5;理论板数均应>2000。色谱见图3。2.4.2线性范围、检出限和定量限取混合对照品溶液,分别进样0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μL,按“2.1.3”项下色谱条件进行测定。以进样量(X)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标,进行线性回归,得DMY的回归方程为Y=0.4682+85.6901X(r=0.9998,n=6),进样量线性范围为200.0~1600.0ng,定量限(LOQ)=4.56ng,检出限(LOD)=0.91ng;MY的回归方程为Y=0.0359+0.0799X(r=0.9997,n=6),进样量线性范围为5.0~56.2ng,LOQ=1.12ng,LOD=0.56ng。2.4.3进样测定条件精密吸取混合对照品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件连续进样5次,每次0.5μL,测定峰面积。结果,DMY与MY的RSD分别为0.96%和2.73%(n均为5),表明仪器精密度良好。2.4.4进样及测峰面积测定取同一供试品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件,分别于0、12、24、36、48、60、72h进样0.5μL,测定峰面积。结果,DMY与MY的RSD分别为1.09%和0.78%(n均为7),表明供试品溶液在72h内稳定。2.4.5加样回收率试验取已知含量的藤茶样品粉末适量,共9份,分别加入高、中、低不同量的混合对照品,各3份,按“2.3”项下方法制备供试品溶液,照“2.1.3”项下色谱条件测定峰面积,计算加样回收率。结果,DMY的平均加样回收率为98.74%,RSD%=1.90%(n=9);MY的平均加样回收率为99.78%,RSD=1.37%(n=9)。2.4.6供试品溶液制备称取同一批藤茶样品粉末适量,共6份,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,照“2.1.3”项下色谱条件进样测定。结果,DMY与MY的RSD分别为1.88%和2.12%(n=6),表明本方法重复性良好。2.5dmy与table的测定精密称取各批样品适量,分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.3”项下色谱条件进样0.5μL,测定峰面积,每批连续进样3次,按外标法以峰面积计算样品中DMY与MY的含量,结果见表4。3藤茶中dmy和私家车本试验首次采用单通道波长切换的方法在同一张色谱图中测定2种成分:前2min检测波长为290nm测定DMY,后2min检测波长为373nm测定MY,分析时间仅为4min,方法简单、快捷、准确,可为藤茶的质量标准研究提供依据。本试验收集了全国19份市售藤茶样品进行分析,样品具有代表性,DMY与MY的含量范围分别为0.53%~35.01%、0~0.62%,二者之和为0.53%~35.30%。由表4可知,藤茶产品质量参差不齐,其中广西产的藤茶中DMY与MY的含量均较高,质量较优;湖南次之。此外,值得注意的是样品JX-1,其DMY与MY的含量均远低于其他样品,其色谱图也与其他样品差别很大,有可能存在掺假的问题。同一产地不同厂家藤茶中DMY与MY的含量也有不同,如GX-1、GX-2和GX-3都产自广西金秀县,DMY含量分别为33.58%、35.01%和27.62%,MY含量分别为0.27%、0.29%和0.19%,这可能与采收时间和加工过程不同有关。由于单一指标成分的测定不能完全反映藤茶的生物活性,笔者建议建立以DMY与MY作为指标成分的藤茶质量控制一测多评技术:藤茶中DMY、MY的含量分别不低于25.00%、0.10%。DMY的邻三酚羟基结构使其稳定性较差,因此在藤茶含测过程中,应注意控制提取温度,注意避光,样品应低温保存并尽快完成测定。藤茶,俗称茅岩莓茶、端午茶、藤婆茶、山甜茶、龙须茶,系葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄Ampelopsisgrossedentata(Hand-Mazz)W.T.Wang的嫩茎叶,主要分布于我国广西、湖南、江西、福建等地。长久以来,藤茶在壮族和瑶族人民中被广泛应用于代用茶饮料,用于治疗黄疸型肝炎、咽喉肿痛、风湿等疾病。研究表明,黄酮类化合物是藤茶的主要活性成分,含量高达38%以上,其中二氢杨梅素(DMY)与杨梅素(MY)含量最高。现代药理研究表明,DMY具有清除自由基、抗氧化、降血脂、抗血栓、抗肿瘤、消炎、抑制肝细胞恶化、保肝护肝等多种功效;MY也具有抗癌、抗皮肤衰老、止痛、抗炎等活性。目前文献报道对藤茶的质量控制以测定DMY为主,主要有薄层扫描法、分光光度法与高效液相色谱(HPLC)法[7~9]。李瑛琦等采用HPLC法在275nm波长下测定DMY与MY,分析时间为15min,但是MY在275nm波长下的响应灵敏度较低。本试验首次采用超高效液相色谱(UPLC)技术、单一检测通道切换波长同时检测DMY与MY,并应用于分析19个市售藤茶商品;同时对DMY与MY