基因表达与功能基因学

基因表达与功能基因学

自1995年出版以来，已经完成了42种微生物遗传因素的筛选，包括杆菌和肠球菌。这些全基因组序列的测定为进一步研究各种微生物的基因功能奠定了基础。研究基因功能的重要方法之一是构建基因的突变体来检测其表型的变化,以推测某个基因在生长过程中起到怎样的作用。最直接的方法是将目的基因敲除,这样可以保证被研究的基因完全失活。微生物基因敲除的传统方法是利用微生物本身的RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组机构,它由RecA和RecBCD组成。RecA蛋白促进各类DNA分子间的同源联会、配对以及链交换和分支迁移。RecBCD分子量较大、是一个由RecB,RecC和RecD组成的复合体,功能多样,是ATP依赖的外切酶V和解旋酶,它与双链切口结合,解开DNA并在Chi位点产生单链DNA,继而由RecA蛋白促进同源重组。由于RecBCD具有核酸外切酶V的活性,所以线性DNA分子在细菌体内会被降解,必须要以环形的质粒状态存在才能不被分解。而且必须将靶基因两侧至少200bp的DNA序列克隆至自杀质粒上,并在其中间插入抗药性基因。通过结合转移,依靠RecA同源重组系统将自杀质粒整合于细菌的染色体上。整合于染色体上的自杀质粒又可以发生第二次同源重组,重组的结果会有两种可能:一是把目的基因敲除,通过抗药性基因的筛选,就可以筛选到二次重组子(即基因敲除的缺失突变体);另一种情况是回复为原始的分子状态。利用RecA重组进行的基因敲除为研究微生物基因的功能奠定了重要的技术基础。应用较广的主要有定点突变、变性双链法实现基因敲除等技术。但是以RecA重组为基础的基因敲除具有较大的不足之处。首先是需要较长的靶基因同源臂,且必须构建具有靶位点的打靶质粒。另外是RecA重组发生几率很低,很难获得所需要的重组子。近来由Murphy和Stewart等人用噬菌体λ的Red重组系统在大肠杆菌中建立的快速敲除原核基因的方法简化了实验操作,使实验周期大大缩短。下面对Red重组系统的组成、重组机理及在微生物基因敲除中的应用做一综述。1蛋白及gam基因的结构特点Red重组系统属于λ噬菌体的重组系统,其编码基因exo、bet和gam置于PL操纵子的控制之下。exo基因的产物是λ核酸外切酶,它可将dsDNA5′端切开,产生3′端突出。由结晶学研究发现,该核酸外切酶在溶液中是环形三聚体,具有一个到达中心的通道,一端可以调节dsDNA,另一端调节ssDNA。bet基因编码的β蛋白,可与ssDNA结合促进互补链的复性,并可以介导DNA链退火和交换反应。它在溶液中的游离状态为环状物,当结合到ssDNA时形成大的环状物,当结合到dsDNA时形成螺旋状纤维。这些结构特点揭示了β蛋白属于重组蛋白家族中的一员,该家族包括Salmonella噬菌体P22的Erf蛋白,E.coli隐蔽型原噬菌体Rac的RecT蛋白,真核生物的Rad52蛋白。β蛋白与λ核酸外切酶形成复合物,调节核酸溶解(nucleolytic)和重组启动。gam基因的产物是一个分子量为16000Da的多肽,结合到宿主的RecBCD蛋白,形成二聚体,抑制RecBCD的外切酶活性。另外E.coli隐蔽型原嗜菌体Rac的重组系统与Red重组系统相似。前者的recE与exo相似,编码一种核酸外切酶;recT与bet相似,编码一种结合于ssDNA促使链交换的蛋白。二者的重组机理相同,可以说是同一类重组系统。2同源重组ssd-pcr检测有关λ噬菌体重组系统方面的研究已有数十年的历史,自上世纪60年代始,就有人报导λ编码的产物可以促进细菌发生重组,Clark和他的同事发现具有λRed系统的菌株在同源重组时不依赖细菌本身的重组系统。因而认为Red重组是一个独立的重组系统。其重组的分子机制如下:同源重组涉及到参与重组的两条dsDNA的断裂和复合。在Red重组系统中,该系统表达的Gam蛋白抑制了宿主RecBCD的所有外切酶活性。然后通过自身表达的λ核酸外切酶和β蛋白完成两条发生同源重组的dsDNA的断裂和复合,剩余重组步骤在宿主蛋白的作用下完成。当发生重组的两条dsDNA都有断裂切口,且不在同一位点时,Red重组系统将以退火的形式促进两条dsDNA的断裂和复合(图1右):λ核酸外切酶结合到两条dsDNA的切口末端,自5′末端向内切割DNA,留下游离的3′末端,在β蛋白的介导下两条双链DNA的单链区发生退火,缺口在连接酶作用下重新连接,形成新的DNA分子。当发生重组的两条dsDNA中只有一条断裂,另一保持完整时,重组将以侵入的形式进行(图1左):λ核酸外切酶结合到断裂的dsDNA的切口处,酶切形成游离3′单链DNA区段。在RecA、β蛋白和一些其他因子的共同作用下,3′单链DNA区段侵入到另一dsDNA分子的因局部解链而产生的单链泡中。形成三链结合(threestrandedjunction),再在RecQ解螺旋酶的作用下发生分支迁移,形成异源双链(heteroduplex),进而在内切核酸酶作用下形成Hollidayjunction,RuvC把连锁在一起的两条DNA分子分开,修复错配的碱基后形成同源双链(homoduplex),同源重组完成。因此该重组方式又被称为分支迁移——异源双链形成——错配修复途径(migeration-heroduplexformation-mismatchrepairpathway)。3roin重组病毒的敲除Ellis、Court和Stewart等研究发现在Red系统的bet基因作用下可以启动E.coli染色体和短的单链寡核苷酸序列间发生重组,导致基因的敲除或置换,因此目前广泛用于原核生物的基因敲除。Red重组系统相对于宿主菌来说是一个外来的功能单位,其重组蛋白表达时在宿主菌内诱导形成“hyper-rac”状态,这种状态将对宿主菌本身的同源重组系统产生影响,从而对菌体本身造成伤害。因此必须对Red重组系统的表达进行控制。一种方法是将λred基因克隆到低拷贝质粒,在诱导型启动子控制下适量表达。Datsenko和Wanner构建了一个Red辅助质粒,包含araC-ParaB启动子和gam、bet和exo三基因片段。由于质粒上具有核糖体结合位点,在阿拉伯糖诱导下Red蛋白可以有效的转录表达,同时它还是一个温度敏感型复制子,当实验中不需要时可以不让其表达。另外一技术是将E.coli的recC-ptr-recB-recD基因簇与red基因置换。置换后的菌株,在敲除已知E.coli的重组基因的同时保持菌株的活力,而且细胞不再承受携带red基因的辅助质粒。DaiguanYu等发展了这一技术,利用温度敏感性λcI抑制子控制λ原噬菌体PL操纵子,从而使exo、bet和gam基因在42℃时表达,32℃时终止。从而保证了Red重组系统在宿主菌中进行瞬时表达,完成靶向基因的敲除,同时也不会或减少了对宿主菌本身重组系统的影响。图2描述了在Red重组系统介导下基因敲除的过程。先合成一对引物,每一条引物的5′端有35～60bp与靶基因同源,3′端与筛选基因(例如抗药性基因)同源,以抗药性质粒为模板,通过PCR获得中间为一个筛选基因,其两端为35～60bp同源臂(图2中A和B)的线性打靶DNA,有时在筛选基因和同源臂间还含有特异性重组位点(SSRTs,site-specificrecombinastionsites)或者限制性酶切位点序列。将线性打靶DNA电击转化到含有Red重组系统的宿主菌后,Red重组系统适量表达,λ核酸外切酶结合到线性打靶DNA两同源臂末端,酶切产生游离3′单链DNA区段,从而使两同源臂和宿主染色体间以链侵入的方式发生重组。线性打靶DNA插入到同源臂A和B间,而宿主染色体上A和B间的DNA序列被其置换,从而完成了对靶分子的定向敲除,得到靶基因缺失的突变体。但是这些缺失突变体中还存在筛选基因(通常是抗药性基因),在构建基因工程菌苗等研究中,都需要去除。去除的方法主要依赖于线性打靶DNA的设计。一种方法是在同源臂间插入研究者感兴趣的基因,将这种线性打靶DNA转化进宿主后,通过同源重组,感兴趣的基因代替原来的筛选基因。另一种方法是在线性打靶DNA的筛选基因和同源臂间插入特异性重组位点,发生同源重组后,重组子的染色体上同样有特异性重组位点,这样在相应位点特异性重组酶(Cre或Flp)的作用下去除筛选基因,只在作用位点留下单一的SSRT。此外,在线性打靶DNA的筛选基因和同源臂间有限制性酶切位点,用相应的限制性酶酶切并重新连接,得到不含有筛选基因的重组子。4遇到的问题和解决方法在实际应用Red重组系统进行基因敲除的过程中可能会遇到一些具体的问题,下面就根据笔者的实验经验简要总结如下。1稀释液二次pcr法基因敲除所用的线性打靶DNA的PCR模板通常是质粒,该质粒本身具有筛选重组子的抗药性基因。可以把第一次PCR的产物稀释1000倍,然后以稀释液为模板进行二次PCR,用第二次PCR产物去转化宿主菌,可大大减少假阳性。也可以利用DpnI消化处理PCR产物,DpnI只作用甲基化的底物,大多数从常用菌株提取的质粒都被甲基化,而PCR得到的线性DNA没有甲基化,这样DpnI限制性内切酶专一性地降解模板质粒,而且DpnI的识别序列只有4个核苷酸残基,在DNA分子中出现的频率高,模板质粒可被完全降解。2转化效率不高为提高电击转化效率,电击用的感受态细胞的制备是一个需要注意的问题。如果OD600值过低或过高都会使转化效率降低,导致实验的失败。根据笔者的经验体会及文献报导,发现细胞的浓度一般在OD600于0.35～0.60间为佳,制备后感受态的终浓度在2～5×1010cells/mL为好,电击前置于冰上。3线性打靶的dna同源臂和序列的确定当线性打靶DNA的同源臂设计不当时,会造成基因的错误敲除。因此线性打靶DNA同源臂的长短以及序列的确定要根据不同的靶基因进行选择。避免同源臂在靶基因所在基因上或靶基因本身上有多个同源序列,造成非必要的同源重组。4抗药性基因筛选有时在筛选平板上长出的抗性克隆,当被转入液体筛选培养基时便不能生长。这里线性DNA瞬时表达了抗生素抗性蛋白导致了这一现象的出现,由于线性DNA携带供筛选用抗药性基因及其启动子,即使线性DNA没有整合进环形靶分子,也可以短暂表达筛选蛋白。为了使假抗性克隆的绝对数量保持在最低限度,电击后在无抗生素选择压力的培养基中培养的时间尽量缩短。5基于roth的基因整合和基因敲除以Red重组系统为基础的基因敲除是最近研究较热的技术方法,对研究微生物基因的功能具有重要的促进作用。因为它与传统的基因敲除方法相比,重组效率明显提高,Muyrers在实验中利用Red重组系统时获得的候选株80%是正确的重组子。Swaminathan也在其一篇论文中阐述了利用Red重组可达到较高的成功率,而且无需采用筛选基因即可鉴定正确的重组子。而且此方法利用线性打靶DNA,不需构建打靶质粒,因此实验周期大大缩短。但到目前为止,此系统还主要应用于大肠杆菌的基因整合和敲除,在其它菌株获得成功的实例较少。Kofoid和Roth在沙门氏菌(Salmonella),Murohy在肠致病性大肠杆菌(enteropathogenicE.coli)和肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicE.coli)中应用Red系统进行基因置换,但所用的同源臂长度达数百碱基或更长。本实验室王恒等在福氏2a痢疾杆菌