一研-抗VEGF人源化单抗工作总结(2005-4)

抗VEGF人源化单抗2010年1月18日第一研究室梁红远目录研究背景目的蛋白表达与纯化抗VEGF鼠单抗制备及筛选抗VEGF单抗人源化12342011/1/182目录研究背景目的蛋白表达与纯化抗VEGF鼠单抗制备及筛选抗VEGF单抗人源化12342011/1/183血管内皮生长因子(VEGF)与疾病2011/1/184Avastin肿瘤转移性结、直肠癌转移性肾细胞癌多形性胶质母细胞瘤乳腺癌等血管内皮生长因子(VEGF)与疾病2011/1/185Lucentis眼科疾病年龄相关性视网膜病变糖尿病视网膜病变角膜移植病变等目录研究背景目的蛋白表达与纯化抗VEGF鼠单抗制备及筛选抗VEGF单抗人源化12342011/1/186VEGF的表达与纯化VEGF基因克隆VEGF蛋白表达鉴定VEGF为同源二聚体蛋白，在大肠杆菌中进行原核表达，目的蛋白为包涵体2011/1/187

DTA-VEGF8-110

表达与纯化（抗原）VEGF的表达与纯化VEGF165

的表达与纯化纯化得到的DTA-VEGF8-110

、VEGF165均能形成二聚体2011/1/188

VEGFR2胞外区在CHO细胞中与hGH融合表达

VEGFR2胞外区基因克隆VEGFR2胞外区表达与纯化VEGFR2胞外区表达与纯化2011/1/189hGH-VEGFR2包被ELISA板，测VEGF165与其结合活性hGH-VEGFR2与VEGF165结合活性测定VEGFR2胞外区表达与纯化2011/1/1810hGH-VEGFR2与DTA-VEGF8-110结合活性测定DTA-VEGF8-110包被ELISA板，测hGH-VEGFR2与其结合活性VEGFR2胞外区表达与纯化2011/1/1811目录研究背景目的蛋白表达与纯化抗VEGF鼠单抗制备及筛选抗VEGF单抗人源化12342011/1/1812DTA-VEGF8-110抗原免疫小鼠制备单克隆抗体，获得19株VEGF特异性的单抗，其中3株单抗有阻断作用单抗制备竞争抑制实验

体外筛选MAb61为IgG1亚型，亲和力4.5×10-9M2011/1/1814阻断实验MAb61对DTA-VEGF8-110与VEGFR2结合有明显的阻断竞争作用

图A:Tris-Hclbuffer组；图B:血管内皮生长因子VEGF165(400ng)组；图C:VEGF165(400ng)与MAb61(16µg)混合组；图D:VEGF165(400ng)和VEGF不相关鼠源同型对照单抗MAbcontrol(16µg)组MAb61在体内对VEGF的中和作用BCAD

鸡胚尿囊膜实验2011/1/1815用A673肿瘤细胞在裸鼠背部皮下接种建立肿瘤模型，肿瘤平均大小约100mm3时裸鼠随机分为PBS、鼠源同型对照单抗MAbcontrol及MAb61三组，每组8只裸鼠，每只裸鼠每次腹腔注射100ug单抗或等体积PBS，一周两次，治疗5次。图A：PBS对照组；图B：MAbcontrol对照组；图C：MAb61治疗组MAb61抗肿瘤作用

肿瘤模型2011/1/1816治疗结束时MAb61组小鼠肿瘤体积相比PBS组（P＜0.001）及MAbcontrol组（P＜0.001）均有显著性差异，PBS组与MAbcontrol组（P＞0.05）无明显差异；MAb61组小鼠肿瘤重量相比PBS组（P＜0.05）及MAbcontrol组（P＜0.05）均有显著性差异，PBS组与MAbcontrol组（P＞0.05）无明显差异；肿瘤体积和重量为means±s.e.m

肿瘤模型MAb61抗体对肿瘤的抑制作用2011/1/1817目录研究背景目的蛋白表达与纯化抗VEGF鼠单抗制备及筛选抗VEGF单抗人源化12342011/1/1818

鼠单抗可变区基因的克隆MAb61重链可变区PCR结果轻链可变区PCR结果

5’RACE

2011/1/1819嵌合抗体的表达及抗原结合活性

嵌合抗体嵌合抗体与抗原结合证明克隆得到的可变区基因正确2011/1/182024h48h72h阴性对照嵌合抗体表达水平测定（OD450）0.3050.4490.8780.158嵌合抗体抗原结合测定（OD450）0.7310.9061.2010.093Signal1与Signal2在48h、72h抗体的表达水平与Signal3比较均有显著性差异（P＜0.001），Signal1与Signal2比较无显著差异（P＞0.05）；Signal1为hGH信号肽，Signal2为带有内含子的抗体信号肽，Signal3为无内含子的抗体信号肽；抗体表达浓度为mean±s.e.m。不同信号肽对抗体表达水平的影响

嵌合抗体2011/1/1821抗体人源化2011/1/1822红色区域为重链CDR，绿色区域为轻链CDR，蓝色区域为人源化位点鼠单抗可变区模型人源化单抗可变区模型MAb61VL为鼠源抗体轻链可变区氨基酸序列；Hum61VL为CDR移植后的抗体轻链可变区序列，与鼠源抗体相同的氨基酸未列出；#代表抗体CDR区；*对应的位点为选择的点突变位点。人源化抗体轻链可变区序列

抗体人源化2011/1/1823抗体人源化MAb61VH为鼠源体重链可变区氨基酸序列；Hum61VH为CDR移植后的抗体重链可变区序列，与鼠源抗体相同的氨基酸未列出；#代表抗体CDR区；*对应的位点为选择的点突变位点。人源化抗体重链可变区序列2011/1/1824

抗体人源化Hch：嵌合抗体重链；Lch：嵌合抗体轻链；Hhu：人源化抗体重链；Lhu：人源化抗体轻链

人源化抗体与抗原结合测定

结合实验竞争实验

人源化轻链对抗体的抗原结合能力影响较大2011/1/1825抗体人源化2011/1/1826红色区域为重链CDR，绿色区域为轻链CDR，蓝色区域为人源化位点鼠单抗可变区模型人源化单抗可变区模型

抗体人源化Hch：嵌合重链Lch：嵌合轻链Hhu：人源化重链Lhu：人源化轻链La：L58与L59双点突变Lb：L71单点突变Lc：L58、59、71三点突变Ha：H28点突变Hb：H48点突变Hc：H66与H67双点突变Hd：H71点突变轻链点突变重链点突变轻链选择L58、L59；重链选择H66、H67点突变恢复亲和力2011/1/1827

抗体人源化Hch：嵌合抗体重链Lch：嵌合抗体轻链Hc：H66与H67双点突变La：L58、L59双点突变Ld：L58、L59及L38三点突变Le：L58、L59及L79三点突变Lf：L58、L59及L81三点突变Lg：L58、L59及L83三点突变H66、H67、L58、L59、L38位点突变后人源化抗体抗原结合能力接近嵌合抗体轻链点突变2011/1/1828人源化抗体抗肿瘤作用2011/1/1829A673细胞肿瘤模型体外亲和力成熟

GAGGTCCAGCTGCAACAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTXXXXXXXXXATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACAAXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTGTTACTGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGGCTXXXXXXXXTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA（VH序列）GACATCCAGATGACTCAGTCTCCAGCTTCACTGTCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTGGAGCAAGTXXXXXXXXXXXXXXXXXXTTAAATTGGTATCAGCGGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGATCTATXXXXXXXXXAACTTGGCAGATGGCATGTCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTAGACAGTATTCTCTCAAGATCAGTAGCCTGCATCCTGACGATGTTGCAACGTATTACTGTXXXXXXXXXXXXAGTAXXXXXXXXXXXTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCC（VL序列）

Hotpot位点2011/1/1830体外亲和力成熟突变位点2011/1/1831轻链突变Ser93Thr94位点；重链突变Gly96Tyr97位点体外亲和力成熟2011/1/1832wildtype

61VLCDR3HotspotMutation大部分突变体亲和力下降或丧失，部分突变体亲和力有所提高体外亲和力成熟2011/1/1833ProteOnXPR36蛋白相互作用阵列系统（SPR）比较相对亲和力体外亲和力成熟2011/1/1834ForteBio’sOctetQK（BiolayerInterferometry）比较相对亲和力体外亲和力成熟轻链突变体氨基酸WildtypeSerThr256-8HisThr256-9AsnThr256