第六章 DNA损伤与修复

第六章DNA损伤与修复

DNADamageandRepair胡芳中南大学生物科学与技术学院分子生物学研究中心1

哺乳动物细胞DNA损伤的发生频率

DNA损伤类型次·细胞-1·天–1单链损伤55000脱嘌呤10000脱嘧啶200O6甲基鸟嘌呤3100胞嘧啶脱氨基200胸腺嘧啶乙二醇270胸苷乙二醇702第一节DNA损伤的原因及后果电离辐射氧自由基烷化剂复制错误碱基类似物紫外线3一、DNA分子的自发性损伤(一)DNA复制产生误差模板核酸外切酶活性DNA聚合酶Ⅰ

错配碱基4

如大肠杆菌碱基配对的错误率为10-1-10-2

DNA聚合酶校正后错误率为10-5-10-6

复制后经校正系统校正，错配率为10-9左右5（二）DNA的自发性化学变化

1.碱基的异构互变DNA分子中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化（如酮式-烯醇式或氨基-亚氨基之间的结构互变)，使配对碱基间的氢键改变。6碱基的互变异构效应

碱基T和G能够以酮式或烯醇式两种互变异构的状态出现碱基C和A能够以氨基式或亚氨基式两种互变状态出现一般生理条件下，碱基互变平衡反应倾向于酮式或氨基式，故A:T和C

G碱基配对

7互变异构效应引起不正常的碱基配对稀有形式常见形式82.碱基的脱氨基作用碱基的环外氨基有时会自发脱落，从而胞嘧啶(C)变成尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)变成次黄嘌呤(H)、鸟嘌呤（G）变成黄嘌呤(X)等。复制时,U与A配对、H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化。93．脱嘌呤与脱嘧啶即碱基脱落，是指从DNA上丢失了嘌呤或嘧啶，形成无碱基位点，称为AP部位（apurine,apyrimidinesite,AP）。10复制时可以插入任何核苷酸。脱落碱基后的脱氧核糖3’端的磷酸二酯键易被水解，造成DNA链断裂。在哺乳动物细胞基因组中，每天每个细胞因N-糖苷键自发水解约丢失10000个嘌呤碱基和200个嘧啶碱基。11

4．碱基修饰与链断裂细胞在正常生理活动中产生的活性氧会造成DNA损伤，产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，还可引起DNA单链断裂等损伤。每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为五万次。125.环出效应13二、物理因素引起的DNA损伤(一)紫外线照射引起的DNA损伤

同一条DNA链相邻嘧啶以共价键连成二聚体(T-T、C-T、C-C)，导致复制不能进行。

14胸腺嘧啶二聚体胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体15

(二)电离辐射引起的DNA损伤直接效应：DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应：DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量而产生具有很高反应活性的自由基，进而损伤DNA。16电离辐射引起DNA损伤的机理17电离辐射引起DNA损伤的机制自由基损害损伤DNA修复系统

MCI假说(mobilechargeinteraction)直接与DNA分子链发生作用，作用的靶点是DNA分子中移动的电子。18电离辐射引起DNA损伤的类型产生·OH自由基，导致碱基变化

脱氧核糖分解

DNA链断裂

交联

DNA链交联和DNA-蛋白质交联19电离辐射导致DNA链的断裂单链断裂：

双链断裂：

C20三、化学因素引起的DNA损伤

(一)烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子的化合物，很容易与生物大分子的亲核位点起反应，使DNA发生各种类型的损伤：1．碱基烷基化2.碱基脱落3．断链4.交联211．碱基烷基化

烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上,烷基化的碱基配对会发生变化.鸟嘌呤胞嘧啶O6-乙基鸟嘌呤胸腺嘧啶222.碱基脱落

烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定，容易脱落形成DNA上的无碱基位点，复制时可以插入任何核苷酸，造成序列的改变。233．断链DNA链的磷酸二酯键上的氧也容易被烷基化，结果形成不稳定的磷酸三酯键，易在糖与磷酸间发生水解，使DNA链断裂。

244.交联烷化剂有两类，一类是单功能基烷化剂，如甲基甲烷碘酸，只能使一个位点烷基化；另一类是双功能基烷化剂，如化学武器氮芥、硫芥等，一些抗癌药物如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、丝裂霉素等，某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类，其两个功能基可同时使两个位点烷基化，结果就能造成DNA链内、DNA链间或DNA与蛋白质间的交联。25(二)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤

人工合成的碱基类似物如5-溴尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、2-氨基腺嘌呤等，其结构与正常碱基相似，进入细胞后能替代正常碱基掺入到DNA链中而干扰DNA复制合成，例如5-溴尿嘧啶的结构与胸腺嘧啶十分相近，在酮式结构时与A配对，但更容易成为烯醇式结构而与G配对，在DNA复制时导致A-T转换为G-C，26

5-BrdU（5-BrdU-A；5-BrdU-G）酮式烯醇式(二)碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤

亚硝酸盐能使胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶（C→U）

羟胺能使胸腺嘧啶脱甲基变成胞嘧啶（T→C）

黄曲霉素B(G→T)27四、DNA损伤的后果

1.点突变(pointmutation)2.缺失(deletion)3.插入(insertion)4.倒位或转位(transposition)5.DNA断裂(DNAbreak)28

DNA突变的类型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-转换

-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-插入A

-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-缺失T野生型基因

-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-

-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G--A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-颠换碱基对的置换(substitution)移码突变(framesshiftmutation)2930第二节DNA修复DNA的修复主要类型:错配修复直接修复光裂合酶修复切除修复重组修复跨损伤修复(SOS修复)

31一、错配修复在DNA复制过程中，DNA聚合酶能够利用其3’一5’外切核酸酶活性去除错配的核苷酸，但是这种校正作用并不十分可靠，某些错配的核苷酸可能逃避检测，出现于新合成的DNA链中。错配修复系统

能够发现和修复这些错配核苷酸.错配的碱基可被错配修复酶识别后进行修复.32

1.E.coli

错配修复机制错配修复系统（Mismatchrepairsystem）DNA腺嘌呤甲基化酶(m6A甲基化酶)解旋酶Helicase

、SSB、外切核酸酶(Ⅰ、Ⅶ、X和RecJ)、DNApolymeraseⅢ、连接酶MCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutS,L,H扫描新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的DNA区段33原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于5`GATC序列中腺苷酸的N6位甲基化。复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列，并以甲基化的链为模板进行修复。34错配修复

35错配修复(大肠杆菌)Mis-pairedbases3637错配修复(大肠杆菌)382.真核细胞错配修复机制3940二.直接修复1.DNA断裂口直接修复在DNA5’-P端和3’-OH端未受损伤的情况下，连接酶能够直接修复DNA的断裂口。412.光复合酶直接修复二聚体423.直接修复烷基化碱基烷基由烷基转移酶（O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶）去除.这种修复反应的主要特点是,甲基从DNA转移至烷基转移酶上,已经甲基化的酶不能再转变为非甲基化的酶,因此,此种修复又称为该酶的自杀性修复。434．直接插入嘌呤DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点，能被DNA嘌呤插入酶(insertase)识别结合，催化游离的嘌呤碱基与DNA无嘌呤部位形成糖苷键。且催化插入的碱基有高度专一性、与另一条链上的碱基严格配对，使DNA完全恢复。44三、碱基切除修复（baseexcisionrepair，BER）指切除和替换由内源性化学物作用产生的DNA碱基损伤,是切除修复的一种。受损碱基切除是由多个酶来完成的。主要针对DNA单链断裂和小的碱基改变及氧化性损伤。45

当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。46碱基切除修复（人）47四、

核苷酸切除修复

（nucleotideexcisionrepair，NER）体内识别DNA损伤最多的修复通路主要修复可影响碱基配对而扭曲双螺旋结构的DNA损伤；修复时切除含有损伤碱基的那一段DNA。48核苷酸切除修复(大肠杆菌)UvrA:识别损伤部位UvrB:解旋双链，3’末端内切紫外线诱导uvrA、uvrB、uvrC和uvrD四种基因表达49UvrB3’末端内切UvrC5’末端内切UvrB3’内切UvrC5’内切50UvrD:解旋酶5152核苷酸切除修复(基因组修复–人)53核苷酸切除修复(转录偶联修复-人类)54GGR和TCR的共同修复通路5556五、重组修复大肠杆菌重组修复57根据DNA末端连接需要的同源性，分为同源重组：需要多种蛋白参与,在减数分裂、细胞有丝分裂后期S/G2期起主要作用。非同源末端连接：DNA分子之间不需要广泛的同源性，主要是在免疫球蛋白重组时对DNA双链进行连接，在细胞有丝分裂G1/G0期起主要作用。

58同源重组修复DNA双链断裂（人）59非同源末端连接修复DSB60DNA损伤的原因电离辐射氧自由基烷化剂复制错误碱基类似物紫外线61DNA的修复主要类型:错配修复直接修复光裂合酶修复切除修复重组修复跨损伤修复(SOS修复)

62六、SOS修复

跨损伤修复：正在复制的DNA聚合酶可能遇到尚未修复的DNA损伤，例如胸腺嘧啶二聚体或无嘌呤位点，复制体必须设法跨越损伤进行复制，或者被迫暂停复制。也称为跨损伤DNA合成。即使细胞不能修复这些损伤，自动防故障系统能够使复制体绕过损伤部位。这一机制目前仅在大肠杆菌中发现。636465RecA-P的三种功能a、DNA重组活性b、与S.S.DNA结合活性c、proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）

RecA-p不表现proteinase活性66当DNA复制受阻/DNAdamaged细胞内原少量表达的RecA-p与ssDNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达SOSopen当DNA复制度过难关后RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff67SOS修复

DNA复制不很严格，新合成的DNA容易造成错误产生突变。68常见的DNA损伤及其修复机制

DNA损伤因素

DNA损伤类型修复机制X射线、氧自由基、烷化剂自发脱碱基单链断裂、无碱基位点、氧化性碱基（如8-氧鸟嘌呤）尿嘧啶碱基切除修复紫外线和多环芳烃环丁烷嘧啶二聚体等大的紫外线光产物和稳定的多环芳烃化合物等大分子DNA加合物核苷酸切除修复抗癌药（如顺铂和丝裂霉素）双链断裂和链间交联双链断裂修复（同源重组修复和末端连接）复制错误和烷化剂碱基错配和缺失（插入）错配修复69七、

线粒体DNA损伤和修复哺乳动物的每个细胞中含有2—100个线粒体，每个线粒体有5—13mtDNA分子，mtDNA只占细胞中DNA总量的10%。人mtDNA是独立于细胞核染色体外的基因组，为环状双链DNA结构，全长为16569bp。一般认为线粒体基因组DNA突变与人类的衰老、进化、神经退行性病变、糖尿病和恶性肿瘤等有关。7071mtDNA自身的特点决定了它比核DNA对氧化损伤更敏感（1）mtDNA是唯一的核外遗传物质并暴露于活性氧环境中；（2）线粒体是氧化还原反应的主要场所。mtDNA与氧化还原体系非常接近，

mtDNA呈裸露状态，缺少组蛋白和非组蛋白对DNA进行保护作用；（3）线粒体本身含有类似微粒体细胞色素P450氧化酶的催化酶，故可直接在线粒体原位激活一些化学致癌物质；（4）mtDNA与富含脂类的线粒体内膜相连，使得mtDNA对脂溶性化学物质及可引起线粒体膜不稳定的因素非常敏感，并往往成为亲电子物质首选的靶点；（5）mtDNA的复制酶由核DNA编码，即使mtDNA损伤十分严重，但如果其相关的复制酶编码基因无损伤或损伤很小，都不会影响损伤的mtDNA复制。这引起mtDNA损伤在细胞内累积，使mtDNA的突变率比核DNA高10倍，而且mtDNA易发生点突变和缺失突变

。72线粒体DNA的氧化损伤: