高校毛细管电泳

高效毛细管电泳一、概述

outline二、基本装置instrument三、基本原理basicprinciples四、主要分离模式

Mainseparatingform

五、毛细管电泳样品收集和浓缩技术六、毛细管电泳的应用

ApplicatioofHPCE七、毛细管电泳法的优缺点与展望AdvantageanddevelopmentofHPCEhighperformancecapillaryelectrophoresis,HPCES0710123范逗逗导师:丁黎教授2023/10/18一.概述

CE是近年来发展较快的一种高效﹑快速的分离技术，在体内药物分析中得到广泛应用。CE具有分离模式多﹑样品用量少﹑适用范围广﹑成本低等特点，是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。2023/10/18一.概述高效毛细管电泳（HighPerformanceCapillaryElectrophoresis，HPCE）又称毛细管电泳（CapillaryElectrophoresis，CE）指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据各组分样品之间淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术。2023/10/18二.基本装置基本结构大致包括:毛细管柱、进样系统、高压系统、检测系统和数据收集系统等。2023/10/18二.基本装置毛细管电泳示意图1.高压电源2.光电倍增管3.液叶冷温控毛细管4.光源5.数据采集6.缓冲液或样品7.缓冲液2023/10/18三.基本原理1.电泳在电解质溶液中,带电粒子在电场的作用下,以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳，迁移速度与哪些因素有关？当带电离子以速度ν

在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—离子所带的有效电荷；E—电场强度；ν—离子在电场中的迁移速度；f—平动摩擦系数(对于球形离子：f=6πηγ；γ—离子的表观液态动力学半径；η—介质的粘度；)2023/10/18所以，迁移速度：（球形离子）

物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。溶质在单位时间间隔内和单位电场下移动的距离为电泳淌度，也称电泳迁移率（electrophoresismobility）。淌度μ

：2023/10/18三.基本原理

2.电渗流现象

当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。

当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。

电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。

2023/10/18HPCE中的电渗现象与电渗流

CE所用的石英毛细管柱，在pH>3的情况下其硅胶表面带负电,和溶液接触时形成了一个双电层.

在高电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流。2023/10/18HPCE中电渗流的大小与方向

电渗流的大小用电渗流速度ν电渗流表示，取决于电渗淌度μ和电场强度E。即

ν电渗流=μE电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即

μ=ε0εξε0—真空介电常数；ε—介电常数；ξ—毛细管壁的Zeta电势。

ν电渗流=ε0εξ

E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算

ν电渗流=Lef/teoLef—毛细管有效长度；teo—电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。2023/10/18HPCE中电渗流的方向

电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：

（1）毛细管改性表面键合阳离子基团；

（2）加电渗流反转剂加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。2023/10/18HPCE中电渗流的流形

电渗是CE中推动流体前进的驱动力，它使整个流体像一个塞子一样以均匀的速度向前运动，使整个流体呈近似扁平型的“塞式流”，它使溶质区带在毛细管内原则上不会扩张。液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍,导致溶质区带本身扩张，引起柱效下降，使其分离效率不如CE。

2023/10/18HPCE中电渗流的作用

电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；

各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：

ν+=ν电渗流+ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；

ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；

ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；正离子最先流出。中性粒子电泳速度为零,故其迁移速度相当于电渗流速度。负离子在中性粒子之后流出,这样因各种粒子迁移速度不同而实现分离。2023/10/18HPCE中电渗流的作用（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。2023/10/18三.基本原理

3.影响电渗流的因素(1).电场强度的影响

电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。(2).毛细管材料的影响

不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；2023/10/18(3).电解质溶液性质的影响溶液pH的影响

对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。2023/10/182023/10/18(5).添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如K2SO4，溶液离子强度增大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流增大。2023/10/18(4).温度的影响

毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。温度变化来自于“焦耳热”；

焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；温度梯度影响溶质迁移速度，使管轴中心的溶质分子要比近管壁的分子迁移得更快，造成谱带展宽，柱效下降。加快散热是减小自热引起的温差的重要途径。采用温度控制装置，尽快除去热量，是系统尽可能地保持恒温。目前常用冷温控制的方法有两种，一种是气冷，一种是液冷。

2023/10/18HPCE中的参数与关系式

parametersandrelationinHPCE1.迁移时间（保留时间）

HPCE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。V—外加电压；L—毛细管总长度；2.分离效率（塔板数）

在HPCE中，仅存在纵向扩散，σ2=2Dt

扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子的依据。2023/10/183.分离度

影响分离度的主要因素；工作电压V；毛细管有效长度与总长度比；有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算：2023/10/18四.主要分离模式毛细管区带电泳（CZE）胶束电动毛细管色谱（MECC或MEKC或CEMC）毛细管等速电泳（CITP）毛细管凝胶电泳（CGE）毛细管等电聚焦（CIEF）毛细管电色谱（CEC）微乳毛细管电泳非水毛细管电泳（NACE）等。其中以CZE、MECC应用最为广泛。

2023/10/18四.主要分离模式CZE，CGE，CITP及CIEF的分析对象为可解离的物质或带电荷的物质，适用于分离生物碱类﹑有机酸类﹑氨基酸类﹑核酸类﹑多肽及蛋白质类﹑黄酮及其苷类、香豆素类等化合物。在蛋白质和多肽的鉴别分析中CZE常用来测定肽谱（蛋白质的一级结构的指纹图谱），CGE常用于测定蛋白质的等电点和蛋白质的富集。MECC除上述物质外，还能分析中性分子，因此，它适用于各类物质的分析。2023/10/18四.主要分离模式最近，又出现了毛细管阵列电泳(CAE)和毛细管电泳免疫分析(CEIA)、芯片毛细管电泳(CC)、亲和毛细管电泳(ACE)、毛细管电泳仪与其他仪器的联用CE-MS,CE-NMR等新技术,所有这些发展都将使CE技术日臻完善。2023/10/18一.毛细管区带电泳（CZE）CZE又称毛细管自由电泳，是CE中最基本﹑应用最普遍的一种模式。前述CE的基本原理即是CZE的基本原理。CZE是根据在电场E中有不同的迁移速度来分离的。2023/10/18二.胶束电动毛细管色谱（MECC）在胶束动电毛细管色谱法的体系中,存在着以胶束形式存在的准固定相和作为载体的液体流动相,溶质在两相之间分配,并且由于其在准固定相和流动相中的分配系数不同差异而在不同的时间流出,从而使得不同性质的物质产生分离。因此，这相当于构成一种不需要的固体支持物来固定液体固定相的液-液分配色谱。它的作用力是在电场作用下的电渗流和电泳。2023/10/18MECC常用的表面活性剂阴离子型：癸基硫酸钠﹑十二烷基硫酸钠（SDS）﹑十四烷基硫酸钠（STS）﹑十二烷基磺酸钠；阳离子型：十二烷基三甲基氯化铵（DTCA）﹑十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）﹑十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）﹑十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；2023/10/18MECC常用的表面活性剂非离子型表面活性剂：辛基葡萄糖苷﹑3-[3-（氯化酰胺基苯基）二甲基胺基]-1-丙基磺酸酯（CHAPS）；手性表面活性剂：胆酸﹑毛地黄皂苷﹑十二烷基-N-L-缬氨酸钠﹑环糊精。其中SDS最为常用，还可以将几种胶束剂混合起来以提高MECC的选择性和分离度2023/10/18三.毛细管凝胶电泳（CGE）CGE是在毛细管中装入凝胶作为支持物进行电泳，应用最多的介质是交联和非交联聚丙烯酰胺凝胶（PAG）。凝胶起类似分子塞的作用，使生物大分子如蛋白质，DNA片段按分子量大小逐一进行分离。2023/10/18三.毛细管凝胶电泳（CGE）凝胶粘度大，抗对流，能减少溶质的扩散，因此能限制谱带的展宽，使峰形尖锐，达到CE的最高柱效。由于溶质和凝胶（或加在凝胶基质中的添加剂）生成络合物，又能使分离度增加，同时