第十二章DNA合成

核酸的生物合成

本章重点介绍遗传中心法则和DNA、RNA的生物合成，对基因工程作一般介绍。

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DNA是绝大多数生物体遗传信息的载体，继1953年Watson&Crick提出DNA双螺旋结构模型后，1958年，Crick提出了“(F)中心法则”(Centraldogma)揭示了遗传信息的传递规律。遗传信息传递的中心法则

蛋白质翻译转录逆转录复制复制DNARNA生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA复制把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过转录传递给RNA，再由RNA通过翻译转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板复制出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为逆转录这是中心法则的补充。

中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命。目录第四节基因工程及分子生物学技术简介第一节DNA的生物合成第二节DNA重组第三节

核酸合成的抑制剂第一节DNA的生物合成

一、DNA的复制（DNA指导下的DNA合成）三、DNA突变四、DNA的损伤与修复二、逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成）一、DNA的半保留复制

1、概念和实验依据

DNA合成的通式及方向

2、原核生物DNA聚合反应有关的酶类

3、原核细胞DNA的复制的起始点和方式5、DNA复制的忠实性6、真核细胞DNA的复制

4、原核细胞DNA的复制过程F半不连续复制)DNA的半保留复制的概念

DNA在复制时，两条链解开分别作为模板，在DNA聚合酶的催化下按碱基互补的原则合成两条与模板链互补的新链，以组成新的DNA分子。这样新形成的两个DNA分子与亲代DNA分子的碱基顺序完全一样。由于子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。原核生物DNA聚合反应有关的酶类

（1）DNA聚合酶(DNApolymetases)（2）引物酶(peimase)和引发体(primosome)

：启动RNA引物链的合成。(3）DNA连接酶（DNAligase）（4）DNA解链酶(DNAhelicase)(5）单链结合蛋白(single-strandbindingprotein,SSB)：结合在解开的DNA单链上，防止重新形成双螺旋。(6）拓扑异构酶(topoisomerase):兼具内切酶和连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋或双螺旋紧张状态变成松驰状态，便于解链。解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物酶和引发体DNA聚合酶ISSB3´3´5´3´5´5´RNA引物复制的忠实性

DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制109-1010碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:a、DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循碱基配对原则）b、DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3’-5’外切酶切除）c、起始时以RNA作为引物DNA的半保留复制实验依据

1958年Meselson&stahl用同位素示踪标记加密度梯度离心技术实验,证明了DNA是采取半保留的方式进行复制.[15N]DNA[14N-15N]DNA[14N]DNA[14N-15N]DNADNA合成的通式及方向DNA合成是以4种dNTP(N=A,T,G,C)为底物，在DNA聚合酶的催化下，向DNA的3’-OH添加脱氧核苷酸使链延长的过程。连接酶连接切口Mg2+连接酶ATP或NAD＋PPi或NMNATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPPOHTGGATCGPTTPPPAACCTGAPACPPPTGGP缺口3'3'5'5'5'5'3'3'模板链模板链大肠杆菌复制起点成串排列的重复序列

GATCTNTTNTTT成串排列的三个13bp序列共有序列共有序列TTATCCACADnaA蛋白结合位点四个9bp序列DnaADnaB(解螺旋酶)SSB大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型DNA复制的方式环状DNA复制时所形成的Q结构起始点复制叉的推进复制叉起始点起始点起始点复制叉复制叉未复制DNA单向复制双向复制原核细胞DNA的半不连续复制复制过程

复制叉的移动方向解旋酶DNA聚合酶III解链酶RNA引物引物体DNA聚合酶ISSB3´3´5´前导链随后链3´5´复制的起始DNA链的合成与延长DNA链合成的终止5´RNA引物3´3´大肠杆菌有三种DNA聚合酶分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用聚合速度(核苷酸/分)持续合成能力主要功能PolⅠPolⅡPolⅢ109,000400+++1000-12003-200DNA修复RNA引物切除120,000100++-24001500DNA修复400,00010-20+++15000-60000≥500000DNA复制比较项目DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶ⅢDNApolymeraseI大片段(Klenowfragment)小片段5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用DNA聚合酶Ⅲ全酶

核心酶PolIII

PolIII延长因子DNA聚合酶Ⅲ二聚体primaseAprimosomeisacomplexofsevenproteins:DnaG

primase,DnaB

helicase,DnaChelicaseassistant,DnaT,PriA,PriB,andPriC.DNALigaseligasefrommanybacteria/pdb/static.do?p=education_discussion/molecule_of_the_month/pdb55_1.html不能催化单链DNA连接必须具有粘性末端双链DNA，而不是平齐末端羟基和磷酸基团必须相邻DNAhelicaseIfIwereanenzyme,IwouldbeDNAhelicase,

soIcouldunzipyourgenesSingle-strandedDNAbindingproteinfrom

M.tuberculosis,

M.lepraeandM.megmatis

SSBtopoisomerasecutsonestrandofaDNAdoublehelixandthenreannealsthecutstrand.cutsbothstrandsofoneDNAdoublehelix,passesanotherunbrokenDNAstrandthroughit,andthenreannealsthecutstrandTypeITypeIIDNA聚合酶催化的链延长反应3´5´模板链5´RNA引物子链3´3´5´5´3´3´5´5´3´大肠杆菌三种DNA聚合酶比较DNA聚合酶Ⅱ分子量每个细胞的分子统计数5´-3´聚合酶作用3´-5´核酸外切酶作用5´-3´核酸外切酶作用转化率DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅲ（复合物）109，000400+++1120，000100++-0.05400，00010-20+++50比较项目DNA聚合酶的3

-5

外切酶水解位点3´3´5´5´错配碱基3´-5´核酸外切酶水解位点复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型聚合酶III全酶引物聚合酶III全酶引物引物体引物体解旋酶解旋酶DNA聚合酶的校对功能

5´-核酸外切酶3´-核酸外切酶裂缝聚合中心裂缝内部DNA聚合酶的校对功能聚合酶错配硷基复制方向正确核苷酸5´5´5´3´3´3´切除错配核苷酸真核细胞DNA复制的特点

多个起点复制起点起点起点起点起点起点

端粒（telemere）复制端粒酶（telomerase）DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持不变。

初步研究表明，人体中生殖细胞的端粒长度保持不变，而体细胞的端粒长度则随个体的老化而逐步缩短。对此的一个推论是：人的生殖细胞具端粒酶的活力，体细胞则否。这一问题的解决无疑会有助于对生命衰老的认识。5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCA端粒酶端粒合成的一种模型3´5´TTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAA3´5´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAAATTGGGTGGGT3´5´AATTTTG5´3´AAAACCCCAAAACCCCCCAGTTTTG整合和杂交移位和再杂交端粒合成的完成TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTT5´3´nAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTCCCCTnAA3´TTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGGT5´3´TTAAAACCCCAAAACCCCAAAACCCCTn进一步加工继续延伸真核和原核DNA细胞复制比较二、逆转录作用1、概念2、逆转录酶3、病毒逆转录过程4、逆转录的生物学意义扩充了中心法则有助于对病毒致癌机制的了解与真核细胞分裂和胚胎发育有关逆转录酶是分子生物学重要工具酶三种功能依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力依赖RNA的DNA聚合酶活力核糖核酸酶H活力

以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。逆转录过程中cDNA的合成

依赖RNA的DNA聚合酶核糖核酸酶H活力依赖DNA的DNA聚合酶逆逆转录病毒的生活周期

生活周期RNA衣壳被膜逆转录酶转录转译整合入宿主细胞染色体DNA进入细胞丢失被膜丢失衣壳逆转录RNARNAcDNA衣壳蛋白被膜蛋白逆转录酶

三、DNA的突变

DNA分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。二、诱变剂的作用

碱基类似物(baseanalog)

碱基修饰剂(basemodifier)

嵌入染料(intercalationdye)

紫外线(ultraviolet)和电离辐射(ionizingradiation)一、突变的类型

碱基对的置换(substitution)

移码突变(framesshiftmutation)

DNA突变的类型

-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G--A-G-