不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响

目录不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响目录摘要 [33]。研究表明，黄甜竹、绿竹、毛竹、苦竹等的提取物都具有很好的抗氧化作用，能有效的清除机体自由基[34]。不同地区不同种类的竹叶在不同季节黄酮含量存在差异[35]。竹叶提取物在小鼠抗衰老试验中，能有效的提高过氧化物歧化酶的活性，降低内脂质过氧化，在体外试验中能很好的清除自由基，表现出有效的抗氧化能力[36]。不同竹种的竹叶提取物抗氧化功效表现出明显的不同，但都具有能抑制机体氧化应激反应的效果。1.1.2竹叶提取物抗炎抑菌作用大量研究表明，竹叶提取物对常见的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有很好的抑制效果[23]。抗菌实验表明不同竹种不同季节的竹叶提取物抑菌效果都不一样[37]。在小鼠气囊滑膜炎试验中，竹叶提取物对该炎症有抑制作用，表现出抗炎效果[38]。研究表明，竹叶提取物主要成分黄酮类化合物能刺激机体免疫细胞的的应答反应，促进增殖分化，分泌抗体，加强机体对炎症反应的抵抗[39]。对家禽生产性能的研究中发现，竹叶提取物能促进胸腺和法氏囊的发育，提高机体的免疫能力。1.2冷应激1.2.1冷应激对生物的影响动植物的生存都离不开一定的环境温度，舒适的温度能够使个体更好的生长发育和繁殖。环境温度的改变是一个很重要的环境应激因素[40,41]。因此，环境温度直接影响着动物植物的生存状态。就人而言，长期处于冷应激环境中，机体稳态必然紊乱，出现各种不适症状，体温逐渐降低，慢慢丧失感觉[42]，严重者便会威胁到生命。寒冷环境主要出现在冬季和高纬度地区，能存活在该条件下的生物必然具有很强的适应能力，从觅食策略到生活习性都能完美的契合生存条件，才不至于被寒冷环境淘汰。1.2.2冷应激对动物各组织的影响应激是机体受内外环境刺激所引起的内环境稳态发生改变的一种状态。应激根据应激源的不同分为冷应激、热应激以及运输应激等，其中对野生动物而言最常见的是以温度变化所引起的冷热应激，也是影响野生动物生活的主要因素。由寒冷刺激引起的冷应激可根据应激持续时间分为急性冷应激和慢性冷应激，其中急性冷应激是指机体短时间内处于低温环境；慢性冷应激通常是由于季节变化导致机体长时间处于低温环境中，导机体感觉神经核运动神经受到抑制，甚至可能发生不可逆损伤[43]。相关研究表明冷应激可引起炎症因子水平的上调，诱导炎症反应的发生，从而引起组织的炎性损伤。炎症反应是一种病理过程，是机体对刺激的一种防御性反应。Fu等发现12℃的冷应激可增加鹌鹑肠道NF-κB的mRNA表达量，引发炎症反应[44]。6-8℃环境中连续冷应激3周可导致大鼠肠道上皮细胞增值率受损，诱导小肠发炎[45]。小鼠在4℃寒冷环境中冷应激2周后，也会发生炎症反应[46]。肉鸡在12℃冷应激条件下会导致肝脏组织的炎性损伤[47]。此外，冷应激还可以一起组织结构的病理学改变，导致组织的形态学损伤。李瑞纲等研究发现，昆明系小鼠每天在4℃环境中冷应激1h，连续30天后，其胃粘膜和肾上腺皮质区均出现出血点[48]。4℃和-12℃的寒冷刺激可以引起9-15周龄雄性SD大鼠的脾脏形态学损伤，表现为白髓萎缩，淋巴小结减少[49]。在对肉鸡的研究中还发现冷应激可引起十二指肠组织的细胞核染色质边集、线粒体肿胀、内质网肿胀，甚至出现明显的细胞凋亡现象[50]。可以明显看出，冷应激会对动物机体产生不利影响，严重则可导致各组织出现不同程度的病理性损伤。冷应激对动物机体有着广泛且复杂的影响，就生产动物而言可以直接影响其生产性能、繁殖性能及产品质量，也会导致发病率和死亡率上升[51,52]。有研究表明，冷应激可以对鸡、鹅[53]、鹧鸪[54]、猪[55]、牛[56]、羊[57]、小鼠[58]和大鼠[59]等的肠道、血清酶活力、精子活力、免疫系统、细胞核基因产生不同程度的影响，导致动物的生长、发育、繁殖、生活、行为等方面的异常状态[60]，还会导致性发育迟缓、血液指标和代谢指标等不良反应，甚至在冷刺激达到一定程度时会致使动物发生关节炎、冻伤、肠炎、腹泻和肺炎等疾病，严重者直接导致动物死亡[61]。1.2.3冷应激对动物生殖器官的影响冷应激对生殖系统也有影响。动物实验显示，雄性长期暴露于冷环境中，其精子密度、精子活动率等显著下降，此外，D级精子比率显著上升，不仅如此，还会对精子的产生速度，睾丸中精子形态造成严重的影响[62]。低温对雄性大鼠有明显的抗生育效果[63]。雌性SD大鼠在冷应激两周后，健康的窦前卵泡、原始卵泡和初级卵泡的出现减少[64]。慢性冷应激能够引起卵泡发育改变而引起生殖损伤[65]。冷应激强度和冷应激频率对大鼠卵巢的黄体细胞与颗粒细胞分泌孕酮的能力也有影响[66]。持续冷应激可激活神经内分泌系统，通过影响下丘脑-垂体-性腺轴，使得雌性大鼠卵巢子宫发育延迟，卵巢重量、子宫重量及血清雌二醇水平显著下降，这些将进一步加重对生殖系统的影响。1.2.4冷应激对生育能力的影响实验显示，母兔在发情期时如突遇寒冷天气，或者引用过量冰水，吃了过冷饲料，都会引起生殖器官的血液循环障碍而引起不孕[67]。国外学者发现将雌性果蝇在放置4℃条件下慢性冷应激3天，发现寒冷对其生育能力有重大影响，子代果蝇的出生率以及子代果蝇的体型明显降低，但机制尚不明确。有学者便提出雌性果蝇能够通过降低生育能力来提高耐寒能力，长期低温导致生育能力受到影响，但在冬季结时生殖能力便开始恢复。以上研究都说明冷应激动物的生殖能力有着明显的影响。1.3研究目的及意义秦岭佛坪冬季和春季持续时间长，从11月开始可持续到来年3月[68]，该地区的大熊猫在此期间都生活在低温环境下，其主食竹为巴山木竹，且基本上只采食竹叶。大熊猫在此期间可能因为寒冷胁迫，需要大量能量而对机体能量进行重新分配，在满足基本需求的前提下再考虑繁殖的问题。能量来源的唯一路径便是采食，通过大量采食的方式来满足在寒冷环境中的高能量需求。在长期的进化过程中，大熊已特化为以竹为主要食物来源的食肉目动物，目前大量研究发现，食草动物在面对一系列的外界环境中生物和非生物因素改变时，会优化觅食策略[69-71]，那么大熊猫在冬季的觅食策略是否与非生物因素寒冷有关？大熊猫在大量采食巴山木竹叶的过程中，获取了大量的营养物质的满足自身能量需求的同时也摄入了大量的植物次生代谢产物。本课题组前期对佛坪大熊猫冬季取食区和非取食区巴山竹叶提取物的化学成分进行了比较分析，在采食区发现了多种具有独特生物活性的生物碱和黄酮类化合物，并通过体外实验进一步验证了佛坪大熊猫主食巴山竹叶提取物的抗氧化活性[67]。由于体内试验与体外试验差异性的存在，且大熊猫为国家级保护动物，无法回归动物实验。因此，选择模式动物昆明小鼠为试验动物，欲通过巴山木竹叶提取物对动物生理活性的研究，验证竹叶提取物对雌性动物在低温环境下泌尿生殖系统的一个抗应激作用，说明长期处于低温环境下的动物，在摄取一定量的竹叶提取物后能对机体产生的不适应情况能起到抑制机体损伤的作用，并对雌性动物的繁殖能力具有维持作用。以此来推测长期处于寒冷环境中大熊猫大量采食巴山木竹叶可能的原因，为进一步探究野外大熊猫在面对生物和非生物胁迫时的最优觅食策略是否与与竹叶中植物次生代谢产物(Plantsecondarymetabolites，PSMs)有关，对大熊猫的保护研究提供一种可能性。1.4研究内容及技术路线1.4.1研究内容本研究使用雌性昆明小鼠进行BLE体内试验，通过在不同温度和灌胃BLE梯度水平条件下，对脏器系数，血清和组织抗氧化，血清免疫指标以及血清雌二醇的检测结果推断出小鼠的最适灌胃剂量。在建立不同环境温度下灌注BLE实验方法学的基础上，研究不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响。通过观察组织病理学切片来初步探究温度与BLE对否对小鼠泌尿生殖系统产生影响甚至造成病理损伤。在通过流式细胞检测技术检测肾脏细胞凋亡率来探究温度与BLE对细胞凋亡造成的影响，以此来初探其作用机制。1.4.2技术路线图1-1技术路线Fig.1-1Technicalroute

第2章不同环境温度下灌注BLE实验方法学的建立第2章不同环境温度下灌注BLE实验方法学的建立2.1材料与方法2.1.1主要仪器及试剂旋转蒸发仪：德国IKA公司RV10型；脂肪测定仪：青岛海能仪器有限公司SOX500型；电子分析天平：德国Sartorius公司；电热鼓风干燥机：上海一恒科学仪器有限公司DHG-9240A型；恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司KD-98-IIA型；乙酸乙酯（Ethylacetate，分析纯），成都科龙公司；巴山木竹叶提取物：实验室自备。巴山木竹叶提取物混悬液：称取适量竹叶提取物干膏，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成竹叶提取物混悬液。巴山木竹叶提取物干膏由实验室自备，提取方法为实验室前人所得[72]。2.1.2竹叶提取物的制备样品预处理：野外采集成熟绿色巴山木竹叶，在实验室洗净后自然烘干，再放入磁盘中，烘干至恒重。最后将巴山木竹叶样品粉碎，粉碎后过60目筛，密封低温保存。竹叶提取物（Bambooleafextract，BLE）的制备：使用电子天平准确称取20.00±0.01g样品，用滤纸包成规则的矩形，确保折叠规整，防止粉末样漏出。将滤纸包放入洁净的样品罐中，向样品罐中加入乙酸乙酯直至没过滤纸包，静置过夜。过夜后，将样品罐中的样品及浸出液都放入脂肪测定仪的抽提管中，进行索式热萃取，不断循环直至抽提管中液体无色透明，萃取完成。将全部萃取液减压过滤后，在旋转蒸发仪中减压浓缩（60±2℃，450mbar），直至成为干膏状。汇总所有干膏并记录后，密封避光低温保存[72]。2.1.3实验动物本研究以7周龄SPF级（specificpathogenfree，SPF）健康雌性昆明小鼠60只（体重为18~22g左右）为研究对象，购于重庆腾鑫生物技术有限公司。2.2动物分组及方法预饲一周后，将小鼠随机分为5组，分别为常温对照组（Normaltemperature+controlgroup）：NT+CON、低温对照组（Lowtemperature+controlgroup）：LT+CON、低温低剂量组（Lowtemperature+lowdosebambooleavesextractgroup）：LT+LBLE（340mg/kg）、低温中剂量组（Lowtemperature+mediumdosebambooleavesextractgroup）：LT+MBLE（680mg/kg）、低温高剂量组（Lowtemperature+highdosebambooleavesextractgroup）：LT+HBLE（1020mg/kg）每组12只，分笼饲养。采用灌胃方式给药，药物实验开始后，各组小鼠于每日早8：00称重、灌胃，自由饮水。剂量组，将竹叶提取物用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成相应的浓度竹叶提取物混悬液，每只小鼠每天按0.02mL/g进行灌胃，常温与低温对照组则灌胃等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。从实验开始时，常温组一直置于25℃，低温各组每天10:00至12:00置于4℃寒冷环境2个小时，连续14d。2.2.1样本采集雌性小鼠实验周期结束后，使用摘眼球采血方法采集1mL左右的新鲜血液于2mL无菌离心管中。室温静置30min后，在高速冷冻离心机（MultifugeX1R，ThermoFisher）中4000r/min4℃离心15min，离心结束后立即分离血清，将血清装入2mL无菌离心管中，做好标记，低温保存，用于后续指标检测。采用颈椎脱臼法处死小鼠后，立即打开小鼠腹腔，取出新鲜肝脏样品，放于-20℃冷冻保存，用于后续指标检测。2.2.2检测指标与方法2.2.2.1脏器系数测定采集样本前对小鼠进行称重，摘眼球采血后，立即打开小鼠腹腔，及时剥离肝脏、肾脏、脾脏以及卵巢，使用电子分析天平称量组织湿重，并计算脏器系数[73]。organcoefficients2.2.2.2血清中SOD检测酶标仪检测血清中SOD的变化情况，取待测血清用生理盐水稀释成不同浓度进行预实验，选取出适宜浓度后使用南京建成试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作。2.2.2.3肝脏中SOD及MDA检测准确称取0.2g肝脏组织，按照重量与体积之比为1:9的比例加入9倍体积的生理盐水，将组织在匀浆机中充分匀浆，制备成10%的肝组织匀浆，2500~300r/min，离心10min，取上清即10%匀浆上清液待测。均使用酶标仪检测SOD和MDA的变化情况，使用南京建成试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作具体操作参照试剂盒说明书。2.2.2.4血清中IL-2、IFN-γ检测酶标仪检测血清中IL-2、IFN-γ的变化情况，使用联科生物试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作。2.2.2.5血清中雌二醇检测酶标仪检测血清中雌二醇的变化情况，使用南京建成试剂盒，严格按照试剂盒说明书进行操作具体操作参照试剂盒说明书。2.2.2.6数据分析所有数据使用Excel2016进行整理，并用SPSS22.0中的ANOVA方法进行数据统计分析，其中P<0.01为差异极显著，以P<0.05为差异显著，结果以平均数±标准误（X̅±SE）表示。2.3实验结果2.3.1脏器系数检测结果低温和灌注BLE对小鼠内脏的脏器系数变化见表2-1。由表2-1可知，温度会导致小鼠肝脏、脾脏、肾脏的脏器系数均呈现下降趋势，但差异不显著（P>0.05），在不同温度下灌注不同BLE浓度各脏器系数均无显著性差异（P>0.05）。从变化规律上看，就肝脏而言，LT+HBLE组最接近NT+CON组；就脾脏而言，LT+LBLE组最接近NT+CON组；就肾脏而言，LT+LBLE组最接近NT+CON组。总体上LT+LBLE组的各脏器系数最接近于NT+CON组。表2-1小鼠脏器系数Table2-1Organcoefficientofmice项目=（12）组别/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE肝脏（mg/g）47.89±5.6241.38±3.0841.74±5.0842.93±4.7046.42±7.63脾脏（mg/g）2.26±0.502.40±0.812.26±0.392.25±0.252.09±0.44肾脏（mg/g）11.40±0.8310.36±0.8210.95±0.9810.76±0.9010.85±1.332.3.2血清中SOD及肝脏中SOD、MDA结果由表2-2可知，温度会引起小鼠血清中SOD含量下降，肝脏中SOD含量下降，MDA含量上升，但差异都不显著（P>0.05）。同一温度下灌注不同BLE，血清中SOD含量呈下降趋势，差异均不显著（P>0.05），肝脏中SOD含量LT+MBLE组和LT+HBLE明显低于LT+LBLE组，且LT+MBLE组和LT+HBLE组与NT+CON之间存在显著性差异（P<0.05），LT+LBLE组与NT+CON组之间无显著性差异；肝脏中MDA含量变化为，LT+MBLE组和LT+HBLE组中均高于LT+LBLE组，但无显著性差异。表2-2小鼠血清中SOD含量及肝脏中SOD、MDA含量Table2-2SODcontentinserumandSOD,MDAcontentinliverofmice项目=（12）组别/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE血清SOD73.26±4.1872.64±4.3572.45±4.0669.88±5.5871.32±5.04肝脏SOD528.92±84.84a438.74±89.74ab487.21±25.12ab406.71±14.10b401.82±36.76b肝脏MDA2.44±0.712.66±0.672.46±0.623.28±0.722.73±0.682.3.3血清中IL-2、IFN-γ结果血清中IL-2、IFN-γ的检测结果见表2-3，由表2-3可知，不同温度下血清中IL-2含量有差异，但是不显著。灌注不同BLE条件下，LT+MBLE组和LT+HBLE组血清中IL-2含量明显高于LT+LBLE组与NT+CON组。不同温度下血清中IFN-γ含量变化为，低温组显著低于常温组（P<0.05），但不同灌注浓度下的IFN-γ含量变化不显著，但LT+LBLE组含量最低。表2-3小鼠血清中IL-2、IFN-γTable2-3IL-2,IFN-γinmouseserum项目=（12）组别/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLEIL-2（pg/ml）1.85±1.031.25±0.581.27±0.801.66±0.911.98±0.50IFN-γ（pg/ml）10.38±3.95a5.74±2.39b2.78±2.55b5.57±3.38b6.22±3.44b2.3.4血清中雌二醇结果由表2-4可知，不用温度下小鼠雌二醇激素含量变化不显著，在不同灌注浓度下，LT+LBLE组与LT+CON组和LT+MBLE组之间存在显著性差异（P<0.05），LT+HBLE组与LT+CON组之间存在差异性。从灌注组总体变化趋势来看，剂量组雌二醇激素含量均低于无剂量组。表2-4小鼠血清中雌二醇检测结果Table2-4Detectionofestradiolinmouseserum组别/GroupNT+CONLT+CONLT+LBLELT+MBLELT+HBLE雌二醇109.32±18.22ab120.28±14.58a86.58±24.50bc115.04±13.96a73.52±8.94c2.4讨论2.4.1不同环境温度下灌注BLE对小鼠脏器系数的影响脏器系数是指实验动物中的某个器官的重量与其体重的比值，又称脏体比。脏器系数是毒理实验中常用的指标，常用于反应某器官的变化，是生理和病理变化的重要指标[74]。脏器系数增大，可能的原因有肥大、水肿、充血等；脏器系数减小，可能的原因有器官退化或者收缩等原因。将取出的肝脏、肾脏、脾脏组织进行了及时称量，并计算出了脏器系数。从实验结果来看，各组织之间有差异，但无统计学意义。单从数值上看，就温度而言，低温组脏器系数低于常温组，低温组中，其中灌注BLE组中的LT+LBLE组各器官脏器系数最接近常温组。因此，推测，低温环境下肝脏、肾脏和脾脏的脏器系数变化不明显的原因可能是低温处理时间较短。但从低温灌注情况下看，灌注中高浓度的BLE脏器系数变化比灌注低浓度的BLE明显，低浓度组的数值最接近常温组和低温无剂量组，低温中剂量和高剂量组都偏离低温无剂量组和常温组较远。综上所述，低温低剂量组是最灌注最理想剂量。2.4.2不同环境温度下灌注BLE对小鼠血清中SOD和肝脏中SOD、MDA的影响研究表明，低温会引起机体的能量变化，导致发生应激反应。环境温度的改变产生的应激反应能引发机体的抗氧化系统失衡，致使氧化应激反应的发生[75]。机体的抗氧化能力可以通过SOD和MDA的活性变化反应出。其中MDA是脂质过氧化终产物，是细胞损伤的指标之一，而SOD能够维持氧化平衡[76]，是抗氧化产物，能够抑制MDA形成并消除自由基。对于血清中SOD含量的变化趋势来看，低温环境下，SOD下降，说明低温造成的应激反应使小鼠的氧化动态平衡发生了变化。对于肝脏中SOD的变化情况来看，不同温度下，低温环境与常温环境中存在显著性差异，说明对于肝脏组织而言，应激反应导致了氧化动态平衡的破坏；灌注低剂量组与常温组之间无显著性差异，说明灌注BLE能致使SOD含量上升，维持机体平衡状态。对于肝脏中MDA的变化情况来看，低温组均高于常温组，说明MDA含量上升，就灌注组而言，低剂量组明显低于中剂量组和高剂量组且低于低温对照组，说明在低温条件下灌注BLE可以减少MDA的含量，减少对机体的氧化损伤，且低剂量组作用最明显。2.4.1不同环境温度下灌注BLE对小鼠免疫因子的影响细胞因子是由活化的免疫细胞分泌产生的，细胞因子水平可以衡量免疫功能的高低。炎症相关因子的表达量的减少可以减少机体的损伤。IFN-γ和IL-2可以直接介导细胞免疫。结果表明，不同温度环境下，低温组免疫因子都低于常温组，且灌注低剂量组中免疫因子水平最低，说明机体免疫应答相较于无剂量组、中剂量组和高剂量组都低。在发生了应激反应的情况下，灌注BLE能减少机体损伤情况，从而减少机体免疫应答。因此，灌注低剂量的BLE能减少机体炎症的发生。第3章不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响第3章不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响3.1材料与方法3.1.1试验材料巴山木竹叶提取物混悬液的制备：巴山木竹叶提取物制备方法同第2章2.1.2。称取适量竹叶提取物干膏，用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成竹叶提取物混悬液。3.1.2试验动物240只雌性SPF级昆明小鼠，6-8周龄，体重18-22g，购于重庆腾鑫生物技术有限公司。3.1.2主要仪器和试剂主要仪器和试剂见表3-1。表3-1主要仪器与试剂Table3-1Maininstrumentsandreagents实验仪器与试剂Experimentalinstrumentsandreagents生产厂家Producer流式细胞仪（CytoFLEX）Backman（美国）eBioscienceTMAnnexinV-FITCApopKit300tests（BMS500fi-300）Invitrogen（澳大利亚）光学显微镜（CX22）OLMPUS（日本）徕卡显微成像系统（DM1000）Leica（德国）苏木素ThermoFisher（美国）伊红ThermoFisher（美国）多聚甲醛成都市科隆化学品有限公司（中国）乙醇成都市科隆化学品有限公司（中国）二甲苯成都市科隆化学品有限公司（中国）3.2试验方法240只雌性昆明小鼠，预饲养一周，使用完全随机法，按照2×2设计，即温度（25℃、4℃）与灌胃剂量（0、340mg/kg）进行二水平因子设计，将240只雌性昆明小鼠分为4组：常温对照组：（Normaltemperature+controlgroup）：NT+CON；常温竹叶提取物组：（Normaltemperature+bambooleavesextractgroup）：NT+BLE；低温对照组：（Lowtemperature+Controlgroup）：LT+CON；低温竹叶提取物组：（Lowtemperature+bambooleavesextractgroup）：LT+BLE，饲养28d，并于14d、28d两个时间点进行采样。采用灌胃方式给药，药物实验开始后，各组小鼠于每日早8：00称重、灌胃，自由饮水。常温与冷应激实验组，将竹叶提取物用0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成相应的浓度，每只小鼠每天按0.02mL/g进行灌胃，常温与冷应激对照组则灌胃等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。从实验开始时，常温组一直置于25℃，冷应激各组每天于10:00时候至14:00时候,置于4℃寒冷环境4个小时，连续28d。在饲养14d和第28d后采集样本。3.2.1卵巢病理组织学观察处死小鼠后及时剥离卵巢组织，均采集小鼠右侧卵巢，按照如下步骤进行检测：1）包埋：采用4%多聚甲醛固定的卵巢组织，将及时分离的卵巢经流水冲洗30min后，剥离周围结缔组织，再放入病理包埋塑料筐中进行脱水（75%乙醇6h，85%乙醇10h，95%乙醇4h，无水乙醇Ⅰ2h，无水乙醇Ⅱ2h），透明（二甲苯Ⅰ20min，二甲苯Ⅱ15min），浸蜡3h，最后包埋卵巢组织块于石蜡中。2）切片：采用LeicaRM2235切片机将卵巢切成5µm厚的薄片，在温水中将组织展平后捞在载玻片上，60℃烘烤切片至少2h。3）染色：烘烤后的切片经二甲苯脱蜡后，流水洗涤20min，再用苏木素染色30min，染色结束后流水洗涤20min，盐酸酒精分化，伊红染色5min，最后梯度酒精脱水，二甲苯透明后用树脂胶封片。4）观察：显微镜下观察卵巢病理学变化，完整地浏览整张组织片，对正常组织或有明显病变部位均采用显微成像系统拍照记录。5）记录结果3.2.2肾脏病理组织学观察处死小鼠后及时剥离肾脏组织，均采集小鼠右肾，检测步骤同第3章3.2.13.2.3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的检测取肾脏组织剪碎后，经300目滤布过滤，250g离心5min，滴管吹掉组织细胞碎片，用PBS调节细胞浓度为106个/ml。再取100ul浓度为106个/ml的单细胞悬液，250g离心5min，弃去上清。之后加入新鲜配置的1X结合缓冲液200μL重悬细胞。在加入5ul的AnnexinV-FITC染色荧光染料染色10min，室温避光。加入10ul的PI染色5min，室温避光。加400μL结合缓冲液，重悬细胞，立即上机检测。使用CytoFLEX流式细胞仪检测，采用Kaluza2.1软件对数据进行分析。3.3数据处理所有数据使用Excel2010进行整理，并用SPSS20.0进行数据统计分析，用双因素分析（UNIANOVA）将温度和剂量两种因素进行比较，结果以平均数±标准误（X±SE）表示，记作p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著3.4试验结果3.4.1卵巢病理组织学观察结果如下图所示，14d时，NT+CON组小鼠卵巢组织中各级卵母细胞结构正常，黄体等结构清晰，组织细胞排列整齐，未见明显的病理学损伤（图3-1a）；NT+BLE组中卵巢中各级结构均正常，未出现明显病理学变化，也未见明显形态学改变（图3-1b）；NT+CON组小鼠卵巢组织中各组织细胞排列整齐，没有明显病理学变化，但存在卵巢内出血现象（图3-1c）；LT+BLE组卵巢组织结构正常，未见明显组织病理损伤，也未见出血或者充血现象（图3-1d）。28d时，NT+CON组、NT+BLE组、LT+CON组和LT+BLE组中卵巢组织结构够正常，均未见明显的病理学变化，也未见明显的形态学改变（图3-2a，图3-2b，图3-2c，图3-2d）图3-1a（NT+CON）：卵巢各结构正常，未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1a（NT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-1b（NT+BLE）：卵巢未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1b（NT+BLE）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-1c（LT+CON）：卵巢组织内见出血现象。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1c（LT+CON）:theOvariantissuewasbleeding.HE,Bar=50μm,200×.图3-1d（LT+BLE）：卵巢未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-1d（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-114d不同环境温度下灌注BLE小鼠卵巢组织结构Figure3-1theOvariantissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat14d图3-2a（NT+CON）：卵巢各结构正常，未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2a（NT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-2b（NT+BLE）：卵巢未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2b（NT+BLE）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-2c（LT+CON）：卵巢未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2c（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-2d（LT+BLE）：卵巢未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-2d（LT+CON）:theOvariantissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-228d不同环境温度下灌注BLE小鼠卵巢组织结构Figure3-2theOvariantissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat28d3.4.2肾脏病理组织学观察结果如下图所示，14d时，NT+CON组小鼠肾脏组织中肾小球肾小管组织结构正常，细胞排列整齐，界限清晰，未见有明显组织病理损伤（图3-3a）。NT+BLE组肾脏组织中各细胞结构均正常，未出现明显病理学变化（图3-3b）；LT+CON组小鼠肾脏组织中出现肾小管上皮细胞肿胀颗粒变性，管腔内见嗜伊红蛋白沉积现象（图3-3c），LT+BLE组肾脏组织中肾小球和肾间质毛细血管扩张充血，肾小囊内见少量丝网状嗜伊红蛋白沉积（图3-3d）。28d时，NT+CON组肾脏组织结构够完整，未见明显的病理学变化（图3-4a），NT+BLE组肾脏组织细胞中肾小管上皮细胞肿胀，颗粒变性（图3-4b），LT+CON组肾小管上皮细胞肿胀呈空泡状，且此状态细胞数目较多（图3-4c），LT+BLE组中肾小管上皮细胞肿胀程度较轻，且此状态细胞数目相对较少（图3-4d）。图3-3a（NT+CON）：肾脏组织结构正常，细胞排列整齐，界线清晰，未见有明显组织病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3a（NT+CON）:Therenaltissuestructureisnormal,thecellsarearrangedorderly,theboundaryisclear,andthereisnoobvioushistopathologicaldamage.HE,Bar=50μm,200×.图3-3b（NT+BLE）：肾脏组织结构正常，未见明显病理损伤。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3b（NT+BLE）:theKidneytissuewasnormalandnoobviouspathologicaldamagewasseen.HE,Bar=50μm,200×.图3-3c（LT+CON）：肾小管上皮细胞肿胀颗粒变性，管腔内见嗜伊红蛋白沉积。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3c（LT+CON）:Swellingandgranulardegenerationofrenaltubularepithelialcells,eosinophilicproteindepositioninthelumen.HE,Bar=50μm,200×.图3-3d（LT+BLE）：肾小球和肾间质毛细血管扩张充血，肾小囊内见少量丝网状嗜伊红蛋白沉积。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-3d（LT+CON）:Theglomerulusandrenalinterstitiumcapillariesweredilatedandcongested,andasmallamountofeosinophilicsilkscreendepositionwasseenintherenalMicrocystis.HE,Bar=50μm,200×.图3-314d不同环境温度下灌注BLE小鼠肾脏组织结构Figure3-3theKidneytissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat14d图3-4a（NT+CON）：肾脏组织结构够完整，未见明显的病理学变化。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4a（NT+CON）:Therenaltissuestructureiscompleteenoughwithoutobviouspathologicalchanges.HE,Bar=50μm,200×.图3-4b（NT+BLE）：肾小管上皮细胞肿胀，颗粒变性。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4b（NT+BLE）:Swellingandgranulardegenerationofrenaltubularepithelialcells.HE,Bar=50μm,200×.图3-4c（LT+CON）：肾小管上皮细胞肿胀呈空泡状。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4c（LT+CON）:Theepithelialcellsofrenaltubuleswereswollenandvacuolated.HE,Bar=50μm,200×.图3-4d（LT+BLE）：肾小管上皮细胞肿胀。HE，Bar=50μm，200×。Figure3-4d（LT+CON）:Swellingofrenaltubularepithelialcells.HE,Bar=50μm,200×.图3-428d不同环境温度下灌注BLE小鼠肾脏组织结构Figure3-4theKidneytissuestructureofBLEmiceperfusedunderdifferentenvironmentaltemperaturesat28d3.4.3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的检测由表3-1可知，28d时BLE灌胃剂量水平对小鼠肾脏细胞凋亡率的影响达到极显著水平（P=0.004）。与CON组相比，BLE灌注组在14d和28d时肾脏细胞凋亡率上升，且上升幅度为14.94%（图3-5a）。与CON组相比，BLE灌注组在14d时肾脏凋亡率有所上升，上升幅度为14.31%；在28d时，肾脏细胞凋亡率极显著上升（P=0.004），上升幅度为47.38%（图3-5b）表3-1不同温度灌胃BLE对小鼠肾脏细胞凋亡率的影响，%Table3-1Effectofbambooleafextractonapoptosisrateofkidneycellsinmiceatdifferenttemperatures,%项目/Items时间/Time组别/GroupP值/P-valueNT+CONNT+BLELT+CONLT+BLE温度/Temperature剂量/Dose交互作用/Interaction细胞凋亡率14d15.13±2.9519.11±5.3418.24±3.1119.31±2.490.6270.4600.668细胞凋亡率28d17.28±1.9829.59±1.9217.14±1.0721.11±3.420.0730.0040.081图4-3不同温度下灌胃BLE对小鼠肾脏细胞凋亡率的影响a）表示温度水平对小鼠肝脏细胞凋亡率的影响，b）表示BLE灌注剂量水平对小鼠肝脏细胞凋亡率的影响Figure4-3Effectofbambooleavesextractonapoptosisrateofmiceliverunderdiferrencetemperature3.5讨论3.4.1不同温度下灌注BLE对小鼠卵巢病理组织学的影响卵巢作为雌性动物生殖系统的核心器官，具有分泌和生殖的功能[77]。因此，卵巢结构正常与否可以直接反应出雌性动物的生殖系统的情况。病理学组织观察结果可以直观的反映出卵巢结构是否出现明显的病变。有研究表明，在低温环境下会引起大鼠卵巢出现异常，导致生殖细胞被破坏，生殖功能受到影响[78,79]。也有研究表明冷应激会导致大鼠卵巢出现明显的病理改变，各级卵母细胞数量明显改变，且颗粒细胞排列紊乱，层数减少[80]。本研究通过对苏木精-伊红染色法观察雌性小鼠卵巢组织的病理情况。在不同环境温度下，低温组与常温组相比小鼠卵巢的各级结构在14d和28d时均未出现明显的病理损伤情况；在相同环境温度下，灌注BLE小鼠卵巢的各级结构在14d和28d时也未出现明显的病理变化，说明不同环境温度下灌注BLE对小鼠的卵巢组织并未产生明显的影响。生殖系统中卵巢这一核心器官未受到明显的损伤，说明小鼠的在生殖系统处于相对正常情况，这与前人研究结果不同，推测可能与试验动物的品种以及低温处理的时间长短有关。3.4.2不同环境温度下灌注BLE对小鼠肾脏病理组织学影响肾脏作为动物泌尿系统的重要器官，其结构的正常与否可以直观的反应泌尿系统的情况。研究表明，寒冷环境会导致SD大鼠的肾脏结构和功能受损，把正常的大鼠持续置于低温环境下会导致肾小球以及肾小管出现明显的炎症现象[81,82]。另有研究表明，反复低温暴露会直接导致肾小管上皮细胞空泡的形成、肾小球肥大等明显的肾损害[83,84]。由此可知，寒冷环境会导致动物的肾脏结构损伤，进而导致功能受损。本实验结果表明，实验前期，LT组与NT组相比，肾脏组织中出现肾小管上皮细胞肿胀颗粒变性，到了实验后期，大部分肾小管上皮细胞肿胀呈空泡状。在低温环境下，灌注BLE后，肾小管上皮细胞肿胀程度较轻，且此状态细胞数目相对较少，由此可见，BLE能够对低温环境下引起的肾脏结构改变具有改善作用，能够对小鼠的泌尿系统起到一定的保护效果，但并不能完全逆转损伤情况。3.4.3不同环境温度下BLE对小鼠肾脏组织细胞凋亡率的影响细胞凋亡表现为机体在受到外源物质影响的时候，内环境稳态会随之改变，为维持稳定，宿主细胞在多基因的控制下程序性死亡。在寒冷环境下，会直接导致脏器受到损伤。结果显示28d时BLE灌胃剂量水平对小鼠肾脏细胞凋亡率的影响达到极显著水平（P=0.004）。与CON组相比，BLE灌注组在14d和28d时肾脏细胞凋亡率上升，且上升幅度为14.94%。与CON组相比，BLE灌注组在14d时肾脏凋亡率有所上升，上升幅度为14.31%；在28d时，肾脏细胞凋亡率极显著上升（P=0.004），上升幅度为47.38%。灌注BLE导致肾脏细胞凋亡率上升，我们推测在低温环境下引起的脏器损伤竹叶提取物中的有效成分未能起到改善作用，这可能与实验动物的品种以及实验处理时长有关系。第4章结论及有待于进一步研究的问题第4章结论及有待于进一步研究的问题4.1结论本研究按照不同温度环境下，不同梯度灌胃剂量，通过脏器系数、血清和组织抗氧化指标检测、血清免疫指标和血清雌激素水平这几个层面筛选出巴山木竹叶提取物对雌性小鼠的最适灌胃剂量。在此基础长探究不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响，按照2×2因子设计，即温度（25℃、4℃）与灌胃剂量（0、340mg/kg）进行二水平因子设计。运用组织病理学流式细胞术等方法，对不同条件下小鼠卵巢组织病理形态，肾脏组织病理形态和肾脏组织细胞凋亡率等指标进行检测。温度和灌胃剂量对小鼠脏器系数无显著影响，说明对小鼠不会产生明显的毒理作用。通过对抗氧化指标的检测，显示出，低温低剂量条件下，SOD含量最高，MDA含量最低，灌注低剂量的BLE在一定程度上刺激机体的抗氧化反应，抵御外界应激对机体的不利影响，一定层面上说明了BLE具有抗冷应激的作用。血清免疫指标结果显示，低温低剂量组含量最低，表明机体免疫应答反应相对较缓和，在此剂量下，缓解了免疫应答。血清中雌激素含量不同处理之间变化幅度大，但都低于低温对照组，说明低温能引起机体激素分泌增加；就不同剂量而言，均低于低剂量组，说明在低温环境下，灌注低剂量的BLE能刺激机体雌激素处于相对稳定水平。因此，得出不同环境温度下灌注BLE实验方法。不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响从两方面看，低温环境和BLE作用下，对小鼠卵巢组织未产生显著影响，表明对小鼠生殖系统影响不大，推测可能是实验处理时间或者实验动物品种的不同导致的；低温环境下小鼠肾脏组织出现不同程度的肿胀，甚至呈空泡状，表明低温引起肾脏组织损伤，灌注BLE后，肾小管上皮细胞任然出现肿胀情况，但相较无剂量组而言，细胞数目较少，且程度相对较轻，表明BLE能在一定程度上缓解低温引起的肾脏组织损伤。4.2有待进一步研究的问题本研究建立了不同环境温度下灌注BLE实验方法，初步探究了不同环境温度下BLE对小鼠泌尿生殖系统的影响。BLE是一种化合物而非纯净物，成分复杂，对其中产生主要作用的成分有哪些还有待进一步探究。而发挥主要作用的成分在进入机体后有时怎样发挥作用还是未知。因此，下一步研究计划为对BLE中主要活性成分进行提纯并定量并进行体外细胞实验进一步验证。致谢参考文献张璐.本经逢原(中医经典文库)[M].2007.李飞跃,喻国光,陈金珠等.竹叶主要化学成分分析及其生物活性研究现状[J].江西林业科技,2006(4):34-36.张英,丁霄霖.竹叶有效成分和抗活性氧自由基效能的研究[J].竹子学报,1996(3):17-24.FaisalH.A.Othman.Primarystudiesonlactoneinbambooleaf[D].ThisisforMSdegreeofZhejiangUniversity,2000.唐莉莉,徐榕榕.竹叶多糖对小鼠移植瘤的抑制作用[J].无锡轻工大学学报：食品与生物技术,1998(3):62-65.张英,丁霄霖,王树英.竹叶特种氨基酸的存在及其生物学意义[J].无锡轻工大学学报,1997(1):29-32.张英,汤坚.竹叶精油和头香的CGC-MS-DS研究[J].天然产物研究与开发,1998(4):38-44.刘翠,王文久.竹叶资源研究进展及开发利用─—兼谈云南丛生竹竹叶资源开发对策[J].林业建设,1999(06):10-14.袁亚男,陈承瑜,杨滨,etal.31种黄酮、酚酸类化合物和10种中药清除DPPH能力考察[J].中国中药杂志,2009(13):80-85.高志强,徐强,宋仲容,etal.黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的密度泛函理论研究[J].化学世界,2008,49(7):439-443.宋仲容,江相兰,李树伟,etal.竹叶提取物的抗氧化活性研究[J].化学研究与应用,2006(1):67-69.马世玉,李莉,罗德生,etal.竹叶水溶性提取液抗氧化作用的实验研究[J].时珍国医国药,2005(06):11-12.倪勤学.黄条金刚竹叶有效组分及其辐射防护作用研究[D].浙江大学,2013.王慧.七种竹叶提取物抗氧化活性及提取工艺优化研究[D].中国林业科学研究院,2012.张蕾,王姝,倪勤学,etal.鹅毛竹叶提取物抗氧化及酪氨酸酶抑制活性的研究[J].浙江林业科技,2014(5):8-15.何跃君,岳永德,汤锋.用清除有机自由基DPPH法评价竹叶挥发油抗氧化能力[J].安徽农业大学学报,2009(03):80-84.刘萍,高云涛,杨露,etal.竹叶兰不同部位提取物清除DPPH自由基的研究[J].北方园艺,2013(19):80-83.ChoiDB,ChoKA,NaMS,etal.Effectofbamboooilonantioxidativeactivityandnitritescavengingactivity[J].JournalofIndustrial&EngineeringChemistry,2008,14(6):765-770.李水芳,戴瑜,李姣娟.阔叶箬竹叶提取物清除自由基能力及抑菌效果的比较研究[J].食品科技,2010(04):181-184.戴承恩.杨梅黄酮降血糖和竹叶黄酮降血脂的分子作用机制初探[D].浙江工业大学,2014.付彦君,陈靖.淡竹叶提取物对实验性高脂血症大鼠血脂的影响[J].长春中医药大学学报,2013,29(6):965-966.王慧霞,王忠义,杨聚才,etal.两种竹提取物的体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