牙源性角化囊肿和成釉细胞瘤体外培养大鼠骨吸收机制研究

牙源性角化囊肿和成釉细胞瘤体外培养大鼠骨吸收机制研究

角质性角质化（obc）和成形细胞瘤（obc）是牙科疾病的常见损伤。这种生长具有局部入侵，通常会导致下颌骨的吸收和破坏。这些病损在颌骨内生长、增大,具有诱导局部骨吸收的能力。早期研究多集中在骨内病变体积的增大对周围骨组织的物理性压迫作用,骨组织具有受压力而吸收增强的生物学特点。近年来随着对骨吸收调控和骨代谢方面研究的不断深入,人们越来越重视病变微环境中细胞间的相互作用,肿瘤或病变细胞一般不直接引起骨组织的破坏,而是通过产生或诱导其他细胞产生骨吸收刺激因子间接影响破骨细胞的分化、成熟和功能活性。因此,牙源性病损局部侵袭性的强弱可能取决于其病变细胞活化破骨细胞及诱导骨吸收的能力。目前,已明确可参与骨吸收调控的相关因子很多,其中前列腺素E2(prostaglandinE2,PGE2)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)等可促进骨吸收,而降钙素(calcitonin,CT)和骨钙素(boneGla-containingprotein,BGP)等则是促进骨形成的相关因子。我们采用体外培养技术检测OKC和成釉细胞瘤的体外骨吸收效应,并采用放射免疫方法定量分析牙源性病损的体外培养上清液中上述几种骨吸收调控因子的含量。材料和方法1.-mem培养基本实验选用的SD大鼠(新生5天)购自国家计划生育委员会动物室;α-MEM培养基购自美国Hyclone公司;所用IL-6、TNF-α、PGE2、BGP和CT放射免疫测定药盒均购自中国人民解放军总医院科技开发中心放免研究所。2.细胞培养和转染无菌收集手术切除的25例牙源性囊肿(OKC14例、OKC伴感染6例、含牙囊肿5例)和7例成釉细胞瘤标本,组织块立即放入D-Hanks液中漂洗3次,再置入α-MEM培养基(含15%胎牛血清,1×10-5U/L青霉素,1×10-5U/L链霉素,25mmol/LHEPES)中漂洗3次,将标本剪切为约1mm×1mm×1mm大小,置于5mlα-MEM培养基中培养24h(37℃,5%CO2),收集培养上清液冻存于-80℃冰箱中备用。用滤纸吸干培养基中的组织块、称重,计算并记录各组织块的重量和培养基体积的比值(g/L)。3.细胞培养及ca2+含量检测乳鼠颅盖骨器官培养及其上清中Ca2+测定采用经典的体外检测骨吸收的方法,完整取出SD大鼠颅盖骨,于D-Hanks液中去除附着于其表面的骨膜及其他软组织,沿冠状缝分离左右侧颅盖骨,经24h预培养(37℃,5%CO2)后,转移至24孔培养板(半侧颅盖骨/孔),各孔含0.4mlα-MEM培养基和0.1ml待测的组织块培养上清(以10g/L的重量体积比值稀释所有样本),空白对照组仅加0.5mlα-MEM培养基,阳性对照组加0.5ml含10μg/LIL-1β和TNF-α的α-MEM培养基,继续培养48h后,收集培养上清液300μl并采用原子分光光度计检测其Ca2+含量。4.脉冲活性测定分别收集各组牙源性病损体外培养上清液800μl,按照试剂盒提供的操作加液程序,分别与缓冲液、标准液、抗体及已知浓度的标记抗原(125I/3H标记)充分作用,于4℃、3500r/min离心25min,弃去上清液,在γ计数器(SN-695B型,上海)或液体闪烁计数器(LS-6500型,USA)上测定脉冲数/放射活性比值,再于标准曲线上求出待测样本浓度。5.牙源活检块的组织学观察每例牙源性病损的一部分均行常规组织学染色以明确诊断。经体外培养24h后的牙源性病损组织块也行常规组织学处理,以观察其形态变化。免疫组化染色采用链亲和素-过氧化物酶技术,分别对广谱角蛋白(AE1/AE3)、角蛋白19(CK-19)和波形蛋白等标记物进行检测。6.骨吸收相关因子含量的影响各病变组与乳鼠颅盖骨共同培养的上清液中Ca2+含量,以及各组培养上清液中TNF-α、IL-6、PGE2、BGP和CT的放免检测含量的组间差异,采用SPSS10.0统计软件的Kruskal-wallis法进行非参数H检验,并对各组骨吸收相关因子含量与Ca2+含量的相关性进行相关回归分析。牙源病理变化对血清ca2+和tnf-的影响OKC和成釉细胞瘤标本在体外培养24h后,其组织结构和细胞形态均无明显改变,广谱角蛋白、角蛋白19以及波形蛋白的免疫组化染色也证实培养后病变组织上皮和结缔组织的免疫组化表达无明显改变(图1~4),故将牙源性病变组织块的体外培养时间定为24h。Kruskal-wallisH检验表明:阳性对照(IL-1β和TNF-α)组及各病损组的Ca2+析出浓度均显著高于空白对照组(P<0.01),其中OKC伴感染组显著高于OKC组和成釉细胞瘤组(P<0.05),其余各病损组之间差异无统计学意义(表1)。各组牙源性病损培养上清中骨吸收因子的放射免疫测定值见表2。Kruskal-wallisH检验结果显示:IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均显著高于空白对照组(P<0.05),而BGP含量与空白对照组之间差异无统计学意义(P>0.05);各病变组之间的比较显示:OKC组和OKC伴感染组的IL-6含量显著高于成釉细胞瘤组(P<0.05);OKC伴感染组CT含量显著高于OKC组和含牙囊肿组(P<0.05);其余各组之间差异无统计学意义(P>0.05,表2)。对所有检测样本的Ca2+含量和各种骨吸收相关因子水平的相关回归分析证实:样本中的IL-6水平与Ca2+析出量密切相关,差异有统计学意义(r=0.552,P<0.01)。骨吸收效应检测OKC和成釉细胞瘤在颌骨内可沿骨小梁间隙向周围浸润性生长,引起骨组织破坏和吸收,这种生物学行为很可能与病变细胞可产生或诱导产生多种骨吸收刺激因子,并在病变局部造成骨吸收亢进有关。以往研究多涉及炎症性牙源性囊肿,证实其在体外具有骨吸收效应。对牙源性发育性囊肿(如OKC和含牙囊肿)及成釉细胞瘤的体外实验研究较少。本实验采用牙源性病损组织块体外培养与乳鼠颅盖骨体外培养相结合的方法,比较了几种牙源性病损的培养上清液引起乳鼠颅盖骨在培养体系中Ca2+的释放量,以比较不同病损在体外的骨吸收效应。结果发现:各组牙源性病损均可显著增加培养体系中的Ca2+释放量,提示各组牙源性病损在体外均具有促进骨吸收的作用,其中OKC伴感染组的体外骨吸收效应显著高于OKC组和成釉细胞瘤组,这可能与囊壁组织受炎症刺激产生多量的细胞因子有关,提示炎症及炎症介质在骨吸收中可能起重要作用。Harris等、Bando等和Gervasio等分别采用波层色谱、免疫组化和ELISA等方法,证实根尖囊肿的骨吸收效应与PGE2、IL-6和TNF-α等骨吸收因子密切相关。本实验采用更为灵敏的放射免疫测定法定量检测牙源性病损培养上清液中多种骨吸收相关因子的含量,结果表明:各组牙源性病损的培养上清液中IL-6、PGE2、TNF-α和CT含量均显著高于空白对照组,其中OKC组和OKC伴感染组的IL-6水平均显著高于成釉细胞瘤组,但与含牙囊肿组相比差异无统计学意义,提示发育性牙源性囊肿所导致的骨吸收可能与IL-6水平增高有关。相关分析也证实:IL-6水平与骨吸收效应指标Ca2+含量密切相关,提示在被检测的几种骨吸收因子中,IL-6可能对牙源性病损所致的骨吸收发挥更主要的作用。由于本实验中牙源性病损的培养上清液与乳鼠颅盖骨体外共孵育的时间有限(48h),这些细胞因子诱发骨吸收的机制可能与活化成熟的破骨细胞有关,是否可同时影响病变微环境中破骨细胞的分化或形成尚待进一步探讨。成釉细胞瘤导致颌骨破坏、吸收的机制可能有别于牙源性囊肿,其临床上的高侵袭性可能还与肿瘤的