奶牛流产布氏杆菌的分离鉴定

奶牛流产布氏杆菌的分离鉴定

布氏杆菌病是一种在世界上流行的人类疾病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。自1895年Marston等首次报道布氏杆菌病以来,已经确定的布氏杆菌有6个种属20个生物型,牛布氏菌病是引起牛流产的主要病因之一,以流产布氏杆菌(Brucellaabortus)感染最常见,以母畜发生流产和不孕,随子宫排泄物和乳汁排出病原菌,公畜发生睾丸炎和不育为主要患病特征。2005年1～5月,黑龙江省大庆市2个牛场(DC1和DC2)、五常市1个牛场(DC3)和伊春市1个牛场的奶牛频繁发生流产。为弄清病因,对4个牛场进行了流行病学调查,同时采集病料,通过病原分离鉴定、血清学诊断和PCR鉴定确定引起奶牛流产的主要病原菌,为牛场布氏杆菌病的预防和控制提供依据。1材料和方法1材料表面1.1疾病宣言1.2培养基和试剂2方法2.1培养基细胞培养将流产胎牛真胃内容物,肝脏和脾脏等病料分别接种于10%的新鲜绵羊血营养琼脂培养基,分别做普通需氧、微需氧和厌氧(烛缸法)培养,37℃培养3～5d后观察菌落形态和有无溶血情况,并进行革兰染色、沙黄孔雀绿和改良Ziehl-Neelsen染色鉴定。2.3细菌的生化特性2.4菌株和引物布氏杆菌IS711(插入序列)在数量和位置上都很保守,所有的种在单染色体上都含有至少1个拷贝的IS711。根据布氏杆菌不同种IS711的不同设计4条引物,分别用于鉴别流产布氏杆菌、猪布氏杆菌(B.suis)和羊布氏杆菌(B.ovis)。引物由上海生物工程技术有限公司合成。P1:5/-TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3′;P2:5/-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3′;P3:5/-GCGCGGTTTTCTGAAGGTTCAGG-3′;P4:5/-CGGGTTCTGGCACCATCGTCG-3′。P1和P2用于鉴定流产布氏杆菌,扩增产物为498bp;P1和P3用于鉴定猪布氏杆菌,扩增产物为285bp;P1和P4用于鉴定羊布氏杆菌,扩增产物为976bp。2.4.2pcr和凝胶电泳采用25μl反应体系:引物浓度均为0.5μmol/L,dNTP浓度200μmol/L,LATaqDNA聚合酶1.25U,PCR缓冲溶液(100mmol/LTris-HCl,pH8.3,50mmol/LKCl,0.1%BSA,20mmol/LMgCl2),DNA模版1μl,补充去离子水至总体积为25μl。反应参数:94℃预变性10min;94℃变性50s,61.1℃退火1min,72℃延伸50s,共30个循环;72℃延伸10min。取8μlPCR产物,用1%的琼脂糖凝胶在0.15×TBE电泳液(0.045mol/LTris-硼酸,0.001mol/LEDTA,pH8.0)中电泳,EB染色,利用凝胶成像系统(GelDoc2000)观察扩增结果。4个牛场送检75份流产奶牛血清。采用国标GB/T18646-2002动物布氏杆菌病诊断技术检测布氏杆菌抗体。同时采用衣原体间接血凝试验(IHA)检测上述血清,按试剂盒使用说明操作。送检血清中DC110份,DC215份,DC320份,DC430份。结果1年生反压h4个牛场奶牛流产发生情况见表1。奶牛流产发生率为9.5%(102/1100),流产发生在妊娠期1～4周、5～7周和8周至产前者分别占9.8%(10/102)、68.6%(70/102)和21.6%(22/102)。2病牛有莲子内皮炎病牛流产前数天开始从阴门流出淡黄色恶臭液体;流产后多数病牛有子宫内膜炎,人工授精比较困难;胎衣不下,呈淡黄色胶冻样浸润,可见纤维蛋白絮状物和脓性分泌物。3胎盘牛检查流产胎牛多数皮下胶胨样水肿,腹腔积液,肝脏肿大,脾脏稍肿大且质软,肾脏胶胨样水肿。未发现畸胎。4细菌的分离和鉴定4.1培养基细菌生长和生物量病料接种培养基,需氧条件下培养3d未见细菌生长,培养1周观察仍未见细菌生长。厌氧培养和微需氧培养至第4d,接种真胃内容物的血液营养琼脂培养基均有细菌生长,菌落中等大小,圆形隆起,表面光滑、湿润,有光泽,无色透明,侧光观察呈轻微乳色和略带蓝灰色,不溶血,不易溶于生理盐水。2份流产胎牛的肝脏和脾脏材料经上述方法培养有相同细菌生长。4.2红色菌体的检测取菌落涂片,革兰染色和改良Ziehl-Neelsen染色后菌体均呈红色;沙黄孔雀绿染色呈蓝色或绿色,细菌呈球杆状或小杆状,多单个散在,无芽孢和荚膜。4.3生物化学试验的结果分离的生化试验结果见表2。根据《伯杰细菌鉴定手册》确定各分离株生化指标符合布氏杆菌的主要特征。5扩增pcr扩增分离到的6株细菌用P1和P2引物作PCR,均扩增出约498bp的片段,P1与P3和P1与P4两对引物均未扩增出目的片段(图1)。6株布氏杆菌均为流产布氏杆菌。6凝集试验结果4个牛场送检血样104份,布氏杆菌试管凝集试验阳性85份,阳性率81.7%,另有11份为疑似阳性(表3)。衣原体IHA检测75份血样,结果均为阴性。党牛和外在血药病人的感染和传氏杆菌病根据流行病学调查、临床症状、病理剖检情况及微生物学和血清学诊断,确诊4个牛场奶牛流产主要由布氏杆菌引起。通过PCR方法扩增布氏杆菌插入子序列IS711,进一步鉴定分离出的6株布氏杆菌均为流产布氏杆菌。布氏杆菌是需氧菌,在有氧条件下生长良好,但是流产布氏杆菌1～4型多数必须有CO2的条件才能生长。本次实验中分离到的流产布氏杆菌只能在5%O2、10%CO2和85%N2的微需氧环境中生长,在有氧条件下1周未见其生长,符合该菌的培养特性。通过流行病学调查及临床症状分析发现,感染布氏杆菌奶牛容易在妊娠后5～8个月间发生流产,剖检流产胎牛普遍表现皮下水肿特别是脐带水肿,腹腔和膝关节腔积液,肝脏肿大,肾脏胶冻样水肿,但未见胎牛畸形,可供临床诊断。引起奶牛流产的原因比较复杂,传染和非传染性因素都可能引起流产。传染性原因包括细菌、霉菌、病毒和原虫感染,其几率分别为50%～65%、20%～25%和15%～25%。奶牛细菌性流产的病原以布氏杆菌较多见。朱战波等在暴发奶牛流产的牛场,从流产胎牛体内分离到流产胎儿弯曲菌,可见由胎儿弯曲杆菌引起的牛流产也不容忽视。非传染性的因素包括营养状况,化学物质、药物、毒素、有毒植物和激素等。各地的气候、饲养管理条件等情况不同,流产的发生率也不同。本次试验中,104头流产牛血清衣原体IHA阴性,也未检测到弯曲菌,说明本地区可能不存在牛衣原体病,布氏杆菌病是造成本地奶牛流产的主要病因。布氏杆菌有高度的侵袭力和扩散力,可以通过正常的皮肤、黏膜侵入机体,也可通过呼吸道、消化道和生殖道传染。目前对布氏杆菌病仍无有效的治疗药物,主要以预防为主。由于该病临床上多呈隐性经过,又缺乏典型症状,极易被忽视。因此奶牛场要坚持每年进行两次布氏菌病血清学检测,对平板凝集试验阳性和可疑者要进一步进行试管凝集试验和补体结合试验,确诊的病牛必须及时予以淘汰,同群健康牛进行免疫接种,防止布氏杆菌病流行。流产母牛血清,流产胎牛的第四胃内容物,肝、脾和羊水等(无菌采集)。10%血液琼脂培养基,按常规方法制备。生化管购自杭州天和微生物有限公司(批号:20041220);LATaqDNA聚合酶、dNTP和Marker购自宝生物工程(大连)有限公司。布氏杆菌试管凝集抗原、阳性血清和阴性血清,购自黑龙江省生物制品一厂(批号:20050103);衣原体试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所(批号:20040512)。对4个牛