植物组织培养实验指导

植物组织培养技术实验指导内蒙古科技大学数理与生物工程学院2010年4月目录实验一培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制实验二植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌实验三番茄子叶愈伤组织诱导培养实验四马铃薯茎段的扩繁培养实验五海棠叶片的离体培养实验六胡萝卜离体根的培养实验七组织培养物的继代培养实验八马铃薯脱毒与组培快繁实验九沙棘组织培养实验方案设计及实施实验一培养器皿的洗涤与环境的消毒及培养基母液的配制常用组织培养的玻璃容器及接种用的玻璃器皿如锥形瓶、培养皿、试管、配置培养基用的试剂瓶、烧杯等以及金属的镊子、剪刀、接种铲等，用前必须经过洗涤，有的还要消毒。一器皿的洗涤方法一般玻璃器皿，特别是第一次使用的新的玻璃器皿，首先用清水充分浸泡后用碱水刷洗，然后用清水充分除去碱液，再用无离子水或蒸馏水刷洗干净后烘十或晾十，待用。检查玻璃器皿是否洗刷干净的标准是：洗后的玻璃器皿沾水后，布满于整个玻璃表面并形成完整的水膜，而不会有不均匀的水珠出现。当玻璃器皿十分肮脏，带有不同的污渍时，则需要特殊的洗涤液浸泡4-12小时，然后再用清水漂洗干净，较常用的是铭酸洗液，它是用重铭酸钾加入浓硫酸配制而成，其腐蚀性极强，对衣物、皮肤等均十分有害，一般尽量避免使用。目前生产有各种合成的化学洗涤剂，可清除各种污物，使用方便，是实验室内常用的。金属用具在第一次使用前必需先用四氯化碳或乙醚等有机溶剂将其表面的防锈油擦洗干净，用布擦十方可使用，每次使用后需用水清洗并保持干燥。二器皿及环境的消毒方法器皿的消毒方法分为：物理方法又可细分为：十热消毒法(Dryheatsterilization):适用于玻璃器皿、金属和一些不怕高温的物品，如培养皿、锥形瓶、各种试剂瓶、刀、剪、镊子等。一般在150°C烘箱内烤2-3小时，在消毒灭菌前将所要消毒的物品包装于固定容器或耐热的包装材料内(如饭盒、培养皿灭菌筒、铝箔纸等)，防止在使用前的再次污染。湿热消毒法(Wetheatsterilization)：不能用干热消毒的物品，如配置好的培养基、易燃的棉花、工作服、口罩等，要使用高压灭菌锅，通过水蒸气压达到灭菌消毒的目的，常用气压为15磅或1.2kg/cm2，温度为121-124C，灭菌20分钟即可达到杀灭细菌、消毒的目的。超滤消毒法(Ultrafiltratesterilization)：不耐热易在高温下分解破坏的药品如某些酶类，某些具有生物活性的物质，如椰乳、抗菌素等，高热常使之失效，常用超滤膜或微孔滤膜过滤，将细菌等污染源除去后方可使用，常用0.45pm孔径的或0.63pm和0.45pm孔径合用，可将最小的细菌除掉，一般细菌的大小为1pm左右。紫外光灯消毒法(Ultravioletirradiation):因消毒效果较弱，要较长时间照射方可达到消毒效果，因此只作辅助方法，如一个1.2x1.2x2.4m2的小接种间需照射2-3小时。2.化学消毒方法(Chemicalsterilizationmethods)常用于桌面、台面、房间的消毒，如用70%的酒精或异丙醇擦拭工作台面，或用新洁尔灭(一种表面活性杀菌剂)喷洒消毒，或用丙二醇(或甲醛及高锰酸钾)熏蒸房间等。实验二培养基母液的配制植物在自然状态下生长时，具有完整的营养体，是属于自养型的，很多营养物质可以自制，对外界营养条件的要求比较简单，而在离体条件下生长的植物器官、组织和整体植物不同，属于异养型，要求的营养条件十分复杂，因此在人工合成培养基的组成和制备上必须全面考虑，满足供应。一、 实验目的配制培养基母液是植物组织培养的基本技术。当需要连续和大量配制培养基时，如果每次都称量药品、溶解并定容，工作将十分繁琐，因此需要将大量元素、微量元素、铁盐、有机物质、激素类分别配制成适当的浓缩液。要求掌握植物组织培养培养基母液的配制方法。二、 实验材料仪器冰箱、电子天平（0.0001g）容量瓶：1000ml,500ml、250ml、100ml、25ml广口储液瓶：500ml、250ml、50ml、25ml烧杯：1000ml、500ml、250ml、100ml、50ml数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺标签纸、胶水、记号笔药品50%酒精、95%酒精、1N盐酸（1N盐酸（HCl）的配制：取浓盐^2.5ml，加入蒸馏水1000ml，即为1N的HCl）、1NNaOH（1N氢氧化钠（或氢氧化钾）的配制：称40gNaOH（或氢氧化钾57.1g）加入蒸馏水1000ml，即为1N的NaOH（1N的KOH）几种常用的培养基所需的大量元素、微量元素、有机物、激素、铁盐等药品、蒸馏水三、 实验步骤按照培养基配方，把大量元素、微量元素、铁盐、有机物、植物激素分类，每一类中各种药品分别称量。如MS培养基各种母液的配制步骤如下：1、大量元素母液：包括用量较大的几种化合物，按表中排列顺序，将每种药品的用量扩大10倍，分别称取，分别溶解，然后按照顺序混合在一起。如钙盐等易发生沉淀的药品不能混合，应单位定容。最后加上蒸馏水，定容至1升或500毫升。在定容时注意用蒸馏水洗净烧杯和玻璃棒以减少误差。定容后的溶液为大量元素母液，配制培养基时，每配1L培养基需吸取该母液100ml或50ml。2、 微量元素母液：因用量少，为了称量精确和方便，常配成100倍或1000倍的母液，即每种药品扩大100倍或者1000倍。逐个溶解，混合在一起成为微量元素母液，每配1L虬6培养基需吸取该母液10ml或者1ml。3、 铁盐：在培养基配制中需要单独配制，它是由硫酸亚铁（FeSO47H20）5.57g和乙二氨四乙酸二钠（Na2-EDTA）7.45g，分别溶解，混合后，用酒精灯加热半小时以上，冷却后定容至1L。冰箱过夜贮藏无结晶析出，否则重新配制。每配l升培养基需加该铁盐母液5ml。4、 有机物质：主要指氨基酸，维生素类物质。它们大都是扩大1000倍，分别称量，分别定容和储存，配制培养基时按需要的量加入。5、 植物激素：常用的有生长素类如：2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）；细胞分裂素类：激动素（KT）、6-苄基氨基嘌吟（6-BA）、玉米素（ZT）。配制时需要单个称量，根据需要可分别用酸、碱或酒精等不同的溶剂溶解后，再用蒸馏水配制成所需的浓度，一般为每毫升含0.1-2mg/ml，配制培养基时按所需要的量分别加入，如2,4-D和6-BA常配成1mg/ml的母液。在配制2,4-D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）母液时，先用几滴95%酒精溶解完全后，加蒸馏水定容，否则会发生沉淀。而激动素（KT）、6-苄基氨基嘌吟（6-BA）、玉米素（ZT）母液时，要用少量的1mol/LHCl或NaOH溶解，最后加水定容。配好的母液要标记好配制的日期以及药物的浓度。

表1MS培养基配方药品名称规定用量(g)扩大倍数称取量(g)母液定容体积/mlMSI(大量元素,包括N、P、K、S、Ca、Mg)NH4NO31.6510X16.51000kno31.919CaCl2.2H2O0.44(若无水:0.332克)4.4MgSO4.7H2O0.373.7KH2PO40.171.7MSII(微量元素,包括B、Mn、Cu、Zn、Mo、Co、I、Cl)KI0.0001661000x0.166200H3BO40.001241.24MnSO4.H2O0.004464.46ZnSO4.7H2O0.001721.72Na2MoO4.2H2O0.000050.05CuSO4.5H2O0.0000050.005CoCl2.6H2O0.0000050.005Fe盐(MSW)Na2.EDTA.2H2O0.03725200x1.49200FeSO4.7H2O0.027851.114msm(有机)烟酸(VB2)0.0005100x0.01200盐酸毗哆醇(VB6)0.00050.01盐酸硫胺素(VB1)0.00010.002甘氨酸0.0020.04肌醇肌醇0.1200x2200

表2N6朱全清(1970)培养基配方药品名配方量(mg/L)母液倍数称取量(g/L)(NH4)2SO4大量兀素46310X4.63KNO3283028.3CaCl2・2H2O1661.66MgSO4・7H2O1851.85KH2PO44004.0Na2-EDTA铁盐37.3100X3.73FeSO4.7H2O27.82.78MnSO4・4H2O二主微量儿素4.01000X4.0ZnSO4・7H2O3.83.8H3BO31.61.6KI0.80.8盐酸硫胺素(VB1)有机物质11000X1.0烟酸0.50.5盐酸毗哆醇(VB6)0.50.5甘氨酸2.02.0药品名称母液倍数称取量（g/L）KNO3-US.大量兀素（1000ml）10X30（NH4）2SO41.34CaCl21.133NaH2PO4.H2O1.5MgSO4.7H2O5肌醇有机物质（250ml）100X2.5盐酸硫胺素（VB1）0.25盐酸毗哆醇（VB6）0.025烟酸（VPP）0.025MnSO4.4H2O微量儿素（250ml）100X0.25H3BO30.070ZnSO4.7H2O0.05Na2MoO4.2H2O0.00625CuSO4.5H2O0.000625CoCl2.6H2O0.000625KI0.01870各种母液配制好后，要贴好标签，注明母液的名称，配制1匚培养基需要的吸取量、母液配制的日期，然后放入冰箱中储存。一般无机物质的母液在冰箱中可保存半年以上，有机物质的母液保存时间在半年以内，但若发现有沉淀或霉变，应立即重新配制。三、注意事项1.药品的质量问题：为了避免杂质及有害物质对组织培养的影响，必须注意药品质量。国内药品采用国际上通用标准，分为：一级，即保证试剂、优质纯试剂GuaranteedReagent,GR级；二级，即分析纯试剂，AnalyticalReagent,AR级；三级，即化学纯试剂，ChemicalPure,CP级；四级，即实验试剂，LaboratoryReagent,LR级。各级均有一定的杂质含量限制范围，其它特殊用的试剂也有特殊的标记，如光谱纯、层析用、组织培养用等。植物组织培养一般用分析纯级试剂。如药品所带结品水不同，应进行换算。例：在配制10XMS大量元素入溶液时，需要称量CaCl2.2H2O为4.4克，现只有无水CaCl2,请问需要称量多少克？计算方法为：4.4XCaCl2/CaCl2.2H2O=4.4x(40+2x35.5)/(40+2x35.5)+2x18=3.3g称量必需准确，一般用1/万〜4/万的分析天平称量，特别如微量元素及激素等，但有些药品不影响基本反应过程的如蔗糖、琼脂等可用1/100粗天平称取。所用的水必须纯净，一般用全玻璃蒸馏器二次蒸馏的重蒸水或者达到一定标准的无离子水。制备好的浓缩液应保存于冰箱中，储备液配置量要依据使用频度而定，一般所制备的储备液最好于1-2个月内使用完，不宜过长时间保存。实验三植物组织培养的培养基配制、分装与灭菌一、 仪器设备及试剂电磁炉天平(0.0001g)高压灭菌锅量筒：10ml、20ml、100ml、500ml烧杯：1000ml、500ml、250ml移液管：1ml、2ml、5ml吸管若干、记号笔三角瓶或试管、试管架锡铂纸、玻璃棒配制好的各种母液，如大量元素母液、微量元素母液、铁盐、有机物、生长调节剂等，个别生长调节剂要随配随用。蒸馏水、pH试纸蔗糖、琼脂等1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。二、 方法和步骤量取所配培养基总体积的2/3体积的蒸馏水，如要配l升培养基，先量取约700ml体积的水。根据培养基配方，用量筒量取所需要的各种元素的母液。物质加入体积或重量大量元素母液(10x)100ml微量元素母液(1000x)1ml有机物质母液(200x)5ml铁盐母液(200x)5ml肌醇(200x)5ml蔗糖30g琼脂7g吸取母液时，注意应先将几种母液按顺序排好，不要弄错以免使培养基中药品成分发生改变。在培养不同的外植体时，应加入不同的激素，如培养康乃馨侧芽或茎段时加入1ml的1mg/ml的6.B4；而胡萝卜愈伤组织培养中应加入2ml的1mg/ml的2,4刀。加入一种母液后应先搅拌均匀，避免因不均而使局部浓度过高而引起沉淀，琼脂可在加入蔗糖调节完pH值后再加入，此时应注意搅拌，以免琼脂或蔗糖沉淀于烧杯底而炭化。调节培养基的pH值，用pH计或pH试纸测定培养基的pH按照培养材料的要求分别用1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液来调节所配制培养基的pH值，一般培养基的pH值约为5.8,培养的材料不同，对培养基的pH值要求也不同。分装加热至沸腾片刻，以使琼脂充分溶解，检查时可注意烧杯内溶液是否透明。将配制并加热好的培养基分别装在事先洗净的三角瓶，用封口膜封口，注明标签，然后和用牛皮纸或报纸包好的培养皿及用三角瓶装好的蒸馏水一道进行高压灭菌。培养基的灭菌一般用医用高压锅来灭菌（方法略），本实验采用全自动高压灭菌锅。培养基的保存消毒过的培养基通常放在接种室或培养室中保存，一般应在消毒后的两周内用完，最好不要超过一个月。三、注意事项激素应在调节pH之前加入，因为有些激素是用酸或碱溶解的，在调节pH好之后加入会改变pH值。pH过酸或过碱对培养基均是不利的，会导致过软或过硬的结果，从而影响培养质量。在本次实验中将下次实验所需的其它材料一同灭菌处理。实验三番茄子叶愈伤组织诱导培养随着生物技术的发展，利用基因工程技术改良番茄性状已成为当前的研究热点之一，作为植物转基因工作的基础，番茄愈伤组织诱导至关重要，它是遗传转化成功的前提和保障。一、 材料和设备超净工作台培养基：（1）种子萌发培养基1/2MS（2）愈伤组织诱导培养基MS+IAA0.5+6-BA2.0带有吸水纸的成套的培养皿，无菌水解剖刀、枪型镊子、刀片消毒剂0.1%的升汞溶液70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球1000毫升的玻璃烧杯数个、酒精灯、火柴、记号笔二、 实验材料番茄种子三、 实验步骤实验材料的处理番茄种子于70%的酒精中浸泡1min，无菌水冲洗1次，再用0.3%NaC1O溶液浸泡20min，用无菌水冲洗5-6次，接种到1/2MS培养基上。接种取下培养瓶的塞子（或锡铂纸），用火灼烧瓶口2cm处，手持培养瓶呈45°角，用消毒镊子把4-8个种子播种于不含任何激素的IS固体培养基的表面，然后立即将烧过的封口棉塞或锡铂纸封住瓶口。每两次转移之间都要用酒精灯灼烧镊子，防止带菌。接种到1/2MS培养基上，温箱中于28°C培养7天后2片子叶完全展开。在无菌条件下，剪取无菌苗的子叶切成5mmx5mm的小块，接种到愈伤组织诱导培养基上，约3周长出淡绿色、结构致密的愈伤组织。接种后在培养瓶上标明培养物名称和培养日期。四、实验报告结果及观察。培养几天后外植体表面开始变得粗糙，有许多光亮点出现，这是愈伤组织开始形成的症状。在数周培养后，将长大的愈伤组织切成小块转移到新的培养基上，用放大镜观察愈伤组织表面特征。作业。写出实验报告。实验马铃薯茎段的扩繁培养实验马铃薯茎段的扩繁培养一、 意义马铃薯(SolanumtuberosumL.)是茄科茄属一年生草本植物。其块茎可供食用，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。在生长期间马铃薯容易受病毒侵染，病毒一旦侵入，表现出各种各样的退化类型。在生产中，主要是利用茎尖分生组织的脱毒培养以提高马铃薯的产量和品质。马铃薯茎段快繁、培育壮苗和诱导试管薯是马铃薯脱毒生产的重要的环节，这些环节的研究对于优化整个茎尖脱毒体系有重要的意义。二、 仪器设备和试剂仪器设备超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，剪刀、镊子、封口膜、酒精灯、小刷子、量筒、滤纸。试剂70%乙醇、0.1%升汞、无菌水、培养基MS三、实验材料经过催芽的马铃薯块茎四、 方法和步骤外植体灭菌：从已催出芽(芽长一般2-4cm)的干净健康马铃薯块茎上掰下芽，用自来水冲洗干净，先放入70%乙醇中消毒30s，再用0.1%的升汞溶液中浸泡8-10min，放入无菌水中浸泡6次，每次5min，然后接种到MS基本培养基上，每个培养瓶中接种1-5个外植体。接种：先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒：开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用70%的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在70%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个侧芽或小段茎，迅速打开三角瓶口，将材料才插入瓶内，注意材料上下端的极性，不能倒插。在酒精灯边盖上封口膜，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。3.培养条件：25°C光照13小时/天，光强1000Lx。实验五丽格海棠叶片的离体培养丽格海棠（BegoniaelatiOr又称玫瑰海棠，属秋海棠科秋海棠属的多年生草本花卉。因其花色艳美、花型多样、花朵硕大、花期特长，尤其是在春节开花，深受市场的欢迎。目前，最好的丽格海棠盆花仍以进口为主，但由于丽格海棠不耐运输，长时间运输不仅使丽格海棠折断受损情况普遍发生，而且对叶片的形状、花的形态也会造成很大的影响，导致观赏效果的严重下降；同时，丽格海棠存在生长周期长，抗病性差和栽培难度大等问题，因此，在国内对丽格海棠进行品种的遗传改良，加强其繁殖和栽培技术的研究已迫在眉睫。它可以用打插、分枝和嫁接繁殖，但是丽格海棠的分枝能力弱，茎段打插成活率低，繁殖速度缓慢无法满足市场需要，有必要进行组织培养研究。二、 仪器设备和试剂仪器设备超净工作台、带有吸水纸的成套的培养皿，剪刀、镊子、封口膜、酒精灯、小刷子、量筒、滤纸。试剂95%乙醇、75%乙醇、75%酒精棉球、0.1%升汞、无菌水、蒸馏水、培养基MS格BA5NM5L三、 实验材料丽格海棠幼嫩叶片四、 方法和步骤1外植体灭菌：取丽格海棠幼嫩叶片，自来水冲洗30-60分钟，剪成1cm2大的小块儿，然后在无菌室（超净工作台）内用75%酒精浸没20秒钟。用0.1%的升汞溶液浸泡10-15分钟，再用无菌水冲洗3-4次，放入已灭菌的培养皿中的滤纸上待用。2接种：先进行无菌室内消毒，用紫外灯照射30-45分钟，地面用低浓度的来苏尔溶液消毒，紫外灯关闭约20分钟后方可进去工作。超净工作台消毒开启无菌风开关，让无菌风吹上30-45分钟后方可工作。并用75%的酒精棉球擦净工作台。接种时先点燃酒精灯，镊子和剪刀都要先浸泡在75%的酒精溶液中。用酒精灯上灼烧好冷却后的镊子、剪刀取出一个叶块，迅速打开三角瓶口，将材料放到瓶内培养基上，一般叶片上表面在上。在酒精灯边盖上封口膜，用记号笔在瓶体上写明日期和材料。3培养条件：25°C光照13小时/天，光强1000Lx。实验六胡萝卜离体根的培养、目的要求胡萝卜是细胞和组织培养中的经典材料且其来源方便，是实验教学的良好材料，本实验的目的是学习胡萝卜离体根培养的基本方法和步骤，学会和掌握愈伤组织诱导的基本技术。二、材料、仪器与试剂材料：市售大而新鲜的胡萝卜。仪器：超净工作台（或无菌箱）、灭菌锅、显微镜、解剖刀、刮皮刀、不锈钢打孔器、长把镊子、烧杯、培养皿、移液管等。试剂：（1）MS培养基，并附加1mg/L2,4-D和2mg/L6-BA;（2）消毒剂。70%酒精和0.1%升汞溶液三、实验步骤1.将胡萝卜用自来水冲洗干净，用刮皮刀除去表皮1-2cm，横切成大约10mm厚的切片。2.胡萝卜片经70%酒精处理15秒后，无菌水冲洗一遍，再用0.1%升汞溶液浸泡6-8min，无菌水冲洗3-4次。将胡萝卜片平放入培养皿中，一手用镊子固定胡萝卜片，一手用打孔器按平行于组织片垂直轴方向打孔。每个小孔应打在靠近微观形成层的区域，务必打穿组织。然后从组织片中抽出打孔器，用玻璃棒轻轻将圆柱体从打孔器中推出，收集在装有无菌水的培养皿中。重复打孔步骤直至制备足够数量的组织圆柱体。4、用镊子取出圆柱体，放入培养皿中，用刀片切除圆柱体两端各2mm长的组织。将剩下的组织切成3个各约2mm厚的小圆片，将制备好的小圆片转移到装有无菌水的培养皿中。用镊子将圆片转到灭菌的滤纸上，将圆片两面的水分吸十，并立即植到培养基表面。将培养物置于25°C温箱中培养，可同时将一部分放到光下培养，比较光下和暗处对诱导愈伤组织的反应。四、实验报告结果及观察。培养几天后外植体表面开始变得粗糙，有许多光亮点出现，这是愈伤组织开始形成的症状。在数周培养后，将长大的愈伤组织切成小块转移到新的培养基上，用放大镜观察愈伤组织表面特征。作业。写出实验报告。实验七组织培养物的继代培养一、 材料和设备材料：从培养4-6周的外植体上长出的愈伤组织、丛生芽或胚状体超净工作台培养基：不同的实验材料培养基不同三角瓶、带有吸水纸的成套的培养皿、镊子、解剖刀70%酒精、95%酒精及70%的酒精棉球酒精灯、火柴、记号笔二、 方法步骤.取材在无菌室的超净工作台内，每次取一瓶培养物，灼烧培养瓶口约20毫米处，用灼烧冷却后的镊子和解剖刀，取出外植体或者愈伤组织放在无菌的培养皿中。每个培养皿中约放4-6个外植体或者愈伤组织。把每块愈伤组织分成两、三个不小于5mm见方的小块。外植体下面向着中心的细胞常呈坏死状，不适宜作继代培养。这些坏死的部分应当与正常的部分分离并弃去。每次操作后要去掉用过的吸水纸并重新盖上培养皿的盖子。.继代转接将正在发育的外植体或愈伤组织转移到新鲜培养基上，接种方法同前。转接后在培养瓶上写明培养物、培养基、日期。长期培养的胡萝卜组织会产生大块愈伤组织。正在发育的愈伤组织作第一次继代培养所用的实验程序与以后每隔四周转移一次建成愈伤组织系的继代培养程序相同。.实验记录将实验记录抄录于笔记本上，注明实验开始的日期、持续期、培养物的数目、污染数目和所作的不同处理。在四星期内，每隔一星期用肉眼观察培养物，记录培养物形态的变化，培养物的生长状态、鲜重变化等，必要时作拍照记录。实验八马铃薯茎尖的脱毒培养马铃薯是世界四大农作物之一，但作为寒地作物，在温暖地区种植容易感染病毒而退化，不能就地留种。而且马铃薯属于无性生殖，以块茎做种，每亩需要125公斤的块茎种薯。这些特性使马铃薯留种调种成为世界难题。“微型脱毒种薯快速繁殖技术”成功地解决了大种薯微型化问题，而且缩短了生长周期。同时，这种优质种薯克服了大种薯用量大、运输不便等缺点，而且健康无毒，具有很好的丰产性。一、 实验目的掌握马铃薯脱毒培养的过程。二、 实验材料马铃薯芽、接种器皿与用具、MS液体培养基、生长素、分裂素等。茎尖培养基：（1L）TOC\o"1-5"\h\zMS大量母液 100mLMS有机 10mL肌醇 10mL铁 5mLMS微量 1mL蔗糖 30g生长素：6-BA，半胱氨酸，赤霉素，IAA各1mL。扩繁培养基：（1L）MS大量母液 100mLMS有机 10mL肌醇 10mL铁 5mLMS微量 1mL蔗糖 30g产种薯培养基：（1L）MS大量母液 100mLMS有机 10mL肌醇 10mL铁 5mLMS微量 1mL蔗糖 80g加香豆素（或矮壮素）50mg,6-BA5mg,光照时间不得多于8小时，时间为2个月。三、实验步骤（一） 材料预处理用1%的洗衣粉将土豆表面的泥土洗掉，再用清水冲洗数遍，室温下放置在阴暗处使之生芽，若需其快速生芽，可用0.1mg/L的赤霉素处理。（二） 剥茎尖将芽从土豆上掰下放入瓶中，瓶口处盖上纱布用自来水冲洗半个小时，将其取出放入0.1%的升汞中浸泡10分钟，之后放入无菌水，待剥。剥茎尖的过程需在超净工作台上进行。首先将解剖镜摆放好，放上灭过菌的培养皿，在培养皿上放上灭过菌的滤纸，将处理好的芽放在滤纸上，用解剖针由外向内逐层剥去茎尖外的叶片（茎尖的大小与脱毒情况成正比，所剥茎尖越小，脱毒越彻底，但不太易于成活，一般茎尖大小0.1-0.88mm，至少带1个叶原基）。将剥好的茎尖接入培养基上，尽量放在中间部位，靠近管壁处不易生长。一般培养4-6周才能成苗。也可以直接用苗进行脱毒将选出的瓶苗，用新洁尔灭喷一下之后，放入超净工作台上，打开封口膜，选择含茎尖的部位，用镊子取下，放在解剖镜下剥茎尖。（三） 切段快繁接种：将试管内的成苗切成数段，放入三角瓶中（使用的是扩繁培养基），只要含一个节间即可，一般14天左右即可成苗。注意：要顺着生长方向插入培养基中，易于生长。扩繁：将接种两周后的苗，用解剖剪切成数段，放入装有培养基的三角瓶中。染菌苗处理：将染菌的上端切下，放入升汞中浸泡5分钟后，取出用无菌水洗一下，放入新的培养基中。（四） 培养条件：21〜25°C、2000-3000lx、12h/d。（五） 2-3周愈伤组织形成，4-5周绿点出现，3-6月长成2-3cm小芽，越慢越好，出芽很快的扔掉。（六） 培养成功的马铃薯脱毒苗，经ELISA（试剂盒）或PCR鉴定。四、 结果与分析1、 愈伤组织形成数目、绿点形成数目。2、 脱毒苗的鉴定结果。3、 切段培养的结果。4、 污染程度与原因分析。五、 提交实验报告。综合实验沙棘组织培养实验方案设计及实施实验目的：1.熟悉利用组织培养的方法扩培沙棘了解组织培养过程中需要注意的事项与步骤掌握组培实验中涉及的实验仪器实验原理：沙棘为胡颓子科沙棘属，是一种落叶性灌木，其特性是耐旱，抗风沙，可以在盐碱化土地上生存，因此被广泛用于水土保持。国内分布于华北、西北、西南等地