定量PCR基本原理及方法

定量PCR基本原理及方法基因有限公司黄妤荧光定量PCR基本原理荧光定量PCR标记方法荧光定量PCR不同方法学的应用内容

定量PCR技术的产生1992年由Higuchi等：使用EB加入PCR反应体系，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度染料荧光强度间接反映核酸的量后来用与双链DNA有更强结合力的SYBRGreenI取代EB荧光定量PCR基本原理荧光定量PCR的定量原理Y：扩增产物数量X：起始模板数量n：扩增循环数Y=X*2n=(1+Ev)Y=X*(1+Ev)n荧光定量PCR的定量原理1.终点法定量原理前提：循环次数n一定、假定Ev相同原理：根据扩增产物的Y量计数反应物中初始模板X的量，即：lnX=lnY-n*ln(1+Ev)=lnY

-b(b为常数)2.实时检测法定量原理前提：扩增产物量相同、Ev相同原理：反应物中原始分子数X与其所需要的扩增循环次数n成反比，由此计算出标本中靶分子的准确含量，即：LgX=LgY–n*Lg(1+Ev)=b–

n*a(a、b为常数)阈值：PCR扩增信号进入相对稳定的对数增长期时的荧光值Ct值：域值所对应的循环数

PCR扩增与实时定量关系图YnCt值阈值LgX=b–

Ct*a

模板的Ct值与其起始拷贝数的对数存在线性关系。利用已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品的Ct值，即可计算出该样品的起始拷贝数。

Ct值与起始模板的对应关系Y轴—Ct值X—起始拷贝数的对数10^0610^0510^0410^0310^0210^01高低低高Ct标准曲线由系列稀释的已知浓度的样品做标准曲线计算待测样品的初始模板浓度LgX=b–

Ct*a绝对定量——未知浓度的样品与标准曲线相比较X1X2Ct1Ct2

基于双链DNA内掺染料的方法LUXAmpliFluorUniprimer

基于引物的方法基于水解的方法TaqMan(5'nucleaseassay)TaqManMGBMGBQuantiprobe/EclipseLNAoligosAdjacentprobes/HybProbesMolecularbeaconsScorpions基于杂交的方法

Non-PCRDNAinvaderAmpliDetRNA(beacons+NASBA)Rolling-circleamplification

基于探针的方法EB

（第一代）SYBRGreen1

（第二代）LCGreenPlusSYTO9（第三代）EvaGreen

荧光定量PCR标记方法双链DNA内掺染料EB

（第一代）SYBRGreen1

（第二代）LCGreenPlus

（第三代）第一代常规双链DNA内掺式染料：

溴化乙锭

(EB)首个应用于均一实时检测的方法RussellHiguchietal.1992

Simultaneousamplificationanddetectionofspecific

DNAsequences.BioTechnology10:413–417荧光信号随双链DNA和出现而增强信号弱，并且EB对PCR扩增有毒性已不再使用第二代常规双链DNA内掺式染料：

SYBR®GreenI价格便宜，使用简便更亮——效果优于EB广泛应用可用于熔解分析+电泳分析LCGreen™I染料饱和后使其在熔解过程中没有空位进行重组

饱和染料毒性低

高浓度可以使DNA达到饱和

降低了染料位置重组的可能LCGreen,LCGreenPlus,SYTO9,EvaGreen

——饱和染料SYBR™GreenI对PCR扩增有毒性，因此必需使用低浓度的染料SYBR®GreenI一些染料在熔解开始后可以重新定位第三代常规双链DNA内掺式染料：5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmission内掺式染料

——SYBR-GreenI

5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmission内掺式染料

——SYBR-GreenI

基于寡核苷酸的标记方法染料标记的引物染料标记的探针外来光能荧光共振能量传递（FRET）原理

所有基于寡核苷酸的方法的共同基础R=报告基团Q=淬灭基团RQRQRQ靠近时发生能量转移报告基团信号减弱，淬灭基团信号增强(FörsterAnn.Phys.1948)FRET=FörsterResonanceEnergyTransferthroughspace基于水解探针的标记方法TaqMan(5'nucleaseassay)TaqManMGBRQ5’3’5’3’5’3’5’3’ExcitationRQQRQRExcitation基于水解探针的标记方法——TaqmanR=报告基团Q=淬灭基团TaqMan探针特点：淬灭基团通常用TAMRA(染料)标记，TAMRA有很强的荧光TAMRA荧光导致人们无法使用该波长范围的其它报告染料用于多通道实验探针长度可能超过30(探针TM通常70℃)

当探针长度超过30bp，TM就无法被准确计算，从而需要进行特殊设计长探针不易于目标序列结合长探针可表现出显著的错配现像RQ=TAMRA3'探针GCTACACAGTCCGGAACTCTCTATAGCATCACACAGGCCTTGAGAGATATR||||||||||||||||Q基于水解探针的标记方法——TaqMan®MGB探针

第二代水解探针，特点：

1.用一个分子钳控制较小的探针大小

2.用一个非荧光淬灭基团来取代TAMRA荧光基团AGGCCTTGAGAGATATRQ(非荧光淬灭基团)NFQQMGB

(DNA小沟结合物)双链DNA小沟上的MGB钳模型更好的设计灵活性和更短的扩增子25bp15bp20bpTaqMan®MGB探针个体小TAMRA探针38-mer:ACTTTTCTGTAAGTAGATATAACTTTTCAAAAAGACAG平行的MGB探针17-mer:CTGTAAGTAGATATAAC基于杂交的标记方法MGBQuantiprobe/EclipseLNAoligosAdjacentprobes/HybProbes（FRET）MolecularbeaconsScorpionsQIAGENQuantiprobeMGBassay*超级碱基：SuperA™SuperT™互补的碱基形成特别牢固的键（类似于G-C键）以提高杂交性能使用于Taqman相同的*基于杂交探针的标记方法——带有MGB钳的杂交探针基于杂交探针的标记方法——

LNA®

寡分子

LockedNucleicAcidprimersandprobes（锁定的核酸引物及探针）什么是LNA?

LNA是一种新型的核酸类似物，它含有一个2‘-O和一个4’-C亚甲基桥。这个桥限制了呋喃核糖环的活动性，并将结构固定于一个坚固的双环构象中，从而提供了更强的杂交表现和额外的生物稳定性

卓越的杂交特性+加强的生物稳定性

与MGB寡分子相似的效力

免费设计服务

引物，TaqMan®

探针(FAM,JOE,TAMRABHQ1etc),

分子信标,Scorpions,LightCycler

探针等例

用TaqMan探针检测C-到-T色氨酸羟化酶(TPH)SNP:5’-(JOE)cagAaACgCtAttgat(BHQ1)-3’

5’-(FAM)tacAgAaATgCtAttgatt(BHQ1)-3’ (LNA碱基用大写字母表示)参考文献：

Lockednucleicacid(LNA)singlenucleotidepolymorphism(SNP)analysisandvalidationusingreal-timePCR.

NucleicAcidsResearch2004Vol32,No6e55

Johnson,HauptandGriffiths

GriffithUniversity,GoldCoast,Qld基于杂交探针的标记方法——

LNA®

寡分子

LockedNucleicAcidprimersandprobes（锁定的核酸引物及探针）RQExcitationXRQQRExcitationEmission基于杂交探针的标记方法——分子信标分子信标特点：最佳信标杆的设计是至关重要的，必需能够折叠成正确的结构否则荧光基团如不能立即靠近淬灭团，会导致高背景信号。如果干的信标杆杂交太强则会影响与目标序列的退火。因此，对于每一个分子信标都必需执行热变性步骤以确定他们的熔解特性。随着循环的进行，背景信号可能会因探针的水解而增加。BeaconDesigner

软件

可从PremierBiosoft公司购买:Oligo1:FluoresceinOligo2:LCRed640ExcitationEmissionTransfer基于杂交探针的标记方法——荧光共振能量传递

双功能引物/探针分子免费设计软件“Scorpio”可从DNASoftware获得：基于杂交探针的标记方法——

蝎子引物基于杂交探针的标记方法——

蝎子引物

反应机理：Step1:引物在目标DNA上延伸Step2:到达变性温度时，淬灭基团脱落Step3:降温过程中，探针序列与特定目标序列结合，没有延伸的引物信号被淬灭+探针

靶序列+结合时荧光信号淬灭基于杂交探针的标记方法——置换探针Yin-yangprobe陰陽蛇基于引物的标记方法——AmplifluorProbe5’3’5’3’5’3’5’3’3’RQ5’RQRQ3’5’QRRREmissionExcitationQR设计软件：RQXExcitationEmission