棕榈油脂肪粉包被蛋氨酸的瘤胃降解效果研究

棕榈油脂肪粉包被蛋氨酸的瘤胃降解效果研究

长期以来，人们认为肿瘤胃微生物能够合成反刍动物所需的全部氨基酸是必要的，所以它不需要补充饲料。研究表明,即使瘤胃微生物蛋白质的合成达到最大程度,进入小肠的氨基酸仍难以满足高产奶牛的需要,从而影响奶牛的产奶性能和牛奶质量。因此,必须增加小肠可吸收的蛋白质和氨基酸数量才能满足其营养需要。于是,人们开始研究增加反刍动物日粮中氨基酸(特别是保护性氨基酸)的方法,以提高反刍动物小肠中可吸收氨基酸(特别是限制性氨基酸)的数量。蛋氨酸作为反刍动物的一种限制性氨基酸,对其保护方法一直以来都是研究热点之一。但目前的保护方法往往存在2方面的问题:1)瘤胃稳定性不好,氨基酸在瘤胃内大量被降解,造成浪费。2)虽然瘤胃稳定性好,但存在过度保护的问题,在真胃和小肠不能被充分降解和吸收。这项试验用尼龙袋法和运动尼龙袋法分别测定不同比例棕榈油脂肪粉包被蛋氨酸在瘤胃的降解率和小肠的释放率。目的在于通过对比其降解规律探索出一种瘤胃稳定性好,小肠吸收率高,加工成本低的保护方法。这对于奶牛氨基酸营养理论体系的充实和完善是非常必要的,同时也具有提高奶牛产奶量和奶质量,降低生产成本和提高经济效益的实际意义。1材料和方法1.1包装材料棕榈油脂肪粉(脂肪酸组成见表1),其瘤胃降解率为0.68%,小肠吸收率为51.40%。1.2保护性蛋氨酸i、保护性蛋氨酸iii,保护蛋氨酸iii,表达蛋白表达向蛋氨酸中分别按30%、40%、50%和60%加入溶化后的棕榈油脂肪粉,边加边搅拌,在搅拌中迅速冷却,得到粉末状保护性蛋氨酸I(RPMet-I)、保护性蛋氨酸II(RPMet-II)、保护性蛋氨酸III(RPMet-III)和保护性蛋氨酸IV(RPMet-IV)。1.3.1尼龙袋酒精袋法试验选用400目的尼龙布,裁成(17cm×13cm)长方形,对折,用双线缝合,并用酒精灯将边烤焦,以免脱丝,制成长×宽为(12cm×8cm)的尼龙袋,用油性笔标号。新袋用前放入瘤胃内72h,取出洗净,然后低温烘干至恒质量,备用。1.3.2尼龙袋2.5选择孔径为400目的尼龙布,裁成(7cm×6cm)的长方形,对折,然后用尼龙线或涤纶线缝双道,制成(6cm×2.5cm)尼龙袋。袋边缘用酒精灯将边烤焦,以免脱丝。处理方法同瘤胃尼龙袋。1.4试验动物和食物1.4.1试验动物选择3头年龄约4岁,体质量约450kg的健康荷斯坦奶牛,安装永久性瘤胃瘘管和十二指肠前端瘘管,供试验使用。1.4.2试验日粮和营养水平按每头奶牛每天采食量配制TMR全混合日粮,试验日粮及营养水平见表2和表3。1.5测试方法1.5.1试验初样品的制备试验时每个瘤胃尼龙袋装待测保护性蛋氨酸样品5g,每4袋(分别装有不同的保护性蛋氨酸)系在一根长50cm半软的塑料管上,一次放6根管,共24个袋。于晨饲时放入瘤胃,塑料管的另一端固定在瘤胃瘘管盖上。取样时间:在瘤胃内放置2、6、12、24、36和48h取出1个塑料管,每种保护性蛋氨酸每个时间点4个重复,取出后放入洗衣机内(中速)冲洗8min,中间换水1次。将尼龙袋从管上取下,放入40℃烘箱内,烘至恒质量(约48h),备测。1.5.2kcl-pcr法将0.4g保护性蛋氨酸样品装入十二指肠尼龙袋中,热压封口机封口,用人工真胃液(250mL0.2mol/LKCL与53mL0.2mol/LHCL混合后,用蒸馏水定容至1000mL)在39℃处理3h。投入十二指肠前端瘘管中,从粪中收集,放入洗衣机内(中洗)冲洗8min,中间换水1次。然后,放入40℃烘箱内,烘至恒质量,备测。1.5.3样品中碘的提取瘤胃和小肠处理后残渣中蛋氨酸含量采用吴维辉推荐的间接碘量法进行测定。称取约0.3g(精确至0.0001g)干燥样品于250mL碘量瓶中,加入100mL水使之溶解,加入2g磷酸二氢钾、5g磷酸氢二钾和2g碘化钾,充分摇匀溶解。准确加入50mL0.1N碘溶液,盖紧胶塞,避光静置一段时间(约10min)使蛋氨酸与碘充分反应。之后加入1mL0.5%的淀粉指示剂,用0.1N硫代硫酸钠标准溶液(用重铬酸钾标定)滴定过量的碘。当反应液由兰色变为无色时反应到达终点,同时作试剂空白试验。计算公式:Met的含量=(V2−V1)×N×Cm×100%=(V2-V1)×Ν×Cm×100%式中:V1—样品测定时消耗硫代硫酸钠标准溶液消耗量(mL)。V2—试剂空白试验时硫代硫酸钠标准溶液的消耗量(mL)。N—硫代硫酸钠标准溶液的浓度(mol/L)。m—样品的质量(g)。C—滴定度,1mL0.1mol/L碘溶液相当于样品的毫克数;测定DL-蛋氨酸时C为7.46。1.6数据的统计和处理试验数据先用Excel表格进行处理后,再用SPSS软件ANOVA单因子分类进行方差分析。2结果与分析2.1矿物添加量对粉质构的影响由表4可见,4种保护性蛋氨酸随瘤胃停留时间的延长,降解率呈线性增加,各时间点降解率与蛋氨酸差异极显著。6～48h降解率RPMet-I和RPMet-II之间差异不显著,RPMet-III和RPMet-IV之间差异不显著,但RPMet-I、RPMet-II与RPMet-III、RPMet-IV差异显著。这说明,50%的棕榈油脂肪粉添加量对蛋氨酸已基本包被完全。其中,RPMet-IV瘤胃保护效果最好,48h瘤胃降解率平均为36.45%;而RPMet-I48h的瘤胃降解率平均达到52.13%,不能很好的保护蛋氨酸安全通过瘤胃。2.2失率线性18h不同保护性蛋氨酸的小肠释放率,根据在小肠停留时间的不同划分时间段统计分析,见表5。由表5可见,随停留时间的延长,小肠消失率线性增加,但18h后增加趋势变缓。RPMet-II与RPMet-III各个时间段小肠消失率差异不显著;6～12h,RPMet-I与RPMet-IV差异显著;12～24h小肠消失率,RPMet-I与RPMet-IV差异极显著;其中,RPMet-IV在小肠停留24h后的消失率平均仅为56.80%,这说明,添加棕榈油脂肪粉比例到60%很可能存在过保护的问题。2.3肠道中断和消失率之间的关系通过对真胃和小肠消失率与肠道内停留时间的相关性研究发现,真胃和小肠消失率与肠道内停留时间呈强正相关性,见表6。3瘤胃诱导氨基酸的降解和释放率斯钦(1996)研究表明,棕榈油包被蛋氨酸和动物油包被蛋氨酸在人工唾液中消化6h的释放率分别为8.13%和11.89%,12h的释放率分别为8.69%和12.09%,在人工真胃液3和6h的释放率分别为59.94%、66.28%和40.73%、50.42%。Berthiaume等(2000)运用尼龙袋法研究了过瘤胃蛋氨酸在瘤胃中的消失率为1、2、4、8、10、12和16h的消失率分别为3.62%、9.22%、18.70%、31.90%、32.26%、36.74%和46.12%。黄金果等利用瘤胃尼龙袋法测定3种动物油包被蛋氨酸的24h瘤胃降解率,分别为47.27%、28.16%和25.86%。这项试验4种保护性蛋氨酸12h瘤胃降解率分别为34.10%、30.81%、21.78%和18.74%,24h瘤胃降解率分别为38.19%、34.88%、26.04%和23.63%。可见,用棕榈油脂肪粉保护蛋氨酸其过瘤胃效果好于上述保护性氨基酸,较普通棕榈油和动物油包被蛋氨酸能更好的通过瘤胃,原因可能是棕榈油脂肪粉本身是经筛选过的过瘤胃脂肪产品。Boer等(1987)研究了运动尼龙袋法测定过瘤胃蛋氨酸在小肠的利用率。Overton等(1998)应用该方法将过瘤胃蛋氨酸在瘤胃中培养3～6h后,得出瘤胃后蛋氨酸的消失率为63%。而NRC(1989)预测的瘤胃后蛋氨酸的消失率为82%。Berthiaume等(2000)测得纤维素酯包被蛋氨酸瘤胃后消失率为78.09%,小肠消失率为74.0%,大肠消失率为4.09%。杨维仁(2004)用吸附MHA、动物油包被Met和硬脂酸包被Met,结果表明,在瘤胃、瘤胃后、小肠、大肠和总消化道中的消失率及蛋氨酸的利用率平均分别为15.34%、78.34%、70.81%、7.53%、94.02%和92.54%,其中动物油包被Met在瘤胃后、小肠、大肠和总消化道中的消失率及蛋氨酸的利用率最高。这项试验中,4种保护性氨基酸小肠的释放率分别为83.27%、73.05%、67.92%和56.80%。除了RPMet-Ⅳ外,其余3种保护性氨基酸小肠释放率都比较高。试验结果表明,随着瘤胃培养时间的延长,保护性蛋氨酸瘤胃的降解率和小肠消失率均呈线性增加,48h的瘤胃降解率平均为36.45%～52.13%,24h后小肠消失率平均为56.80%～83.27%。这说明,添加30%～60%的棕榈油脂肪粉可显著降低蛋氨酸的瘤胃降解率,