第四章 细胞工程

第四章细胞工程教学重点、难点、学时4.1概述4.2微生物细胞工程4.3植物细胞工程4.4动物细胞工程4.5细胞工程在环境方面的应用1、要点细胞工程基础知识、微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程、利用细胞融合技术构建环境工程菌、抗污染型植物2、重点细胞工程的定义、微生物细胞融合、植物组织培养、植物原生质体制备、培养和融合、动物细胞融合、3、学时

4学时教学要点、重点、学时概述（一）细胞工程的概念是指在细胞水平上的遗传操作，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的技术。

4.1概述（二）细胞工程的分类1、按研究对象中需要改造的遗传物质不同，将细胞工程分为基因工程、染色体工程、染色体组工程、细胞质工程和细胞融合等五个方面。2、细胞工程按其对象不同，也可分为微生物细胞工程、植物细胞工程和动物细胞工程。概述4.1概述（三）细胞1、细胞的大小与形态概述各类细胞大小的比较4.1概述细胞形态的多样性酵母菌植物纤维细胞植物表皮细胞动物精子概述2、细胞的结构

根据细胞的内部结构，可将生物界的细胞分为两大类：原核细胞和真核细胞

4.1概述纤毛细胞壁拟核鞭毛核糖体质膜内含物细菌结构模式图概述微丝叶绿体线粒体质膜液泡细胞核内质网微管细胞壁高尔基体植物细胞模式图动物细胞模式图微丝微管质膜线粒体中心体细胞核溶酶体内质网高尔基体(1)无丝分裂——无纺锤丝出现，染色体（DNA）复制后直接移到两个仔细胞中。(2)细胞增殖周期（有丝分裂）G0期：休眠期G1期：DNA合成前期S期：DNA合成期G2期:DNA合成后期

M期：有丝分裂期3、细胞的分裂和分化①细胞分裂间期②

有丝分裂期前期中期后期末期子细胞分为G1期、S期和G2期三个阶段。新生细胞的去向：重新进入细胞周期、细胞分化成为Go期细胞4.2微生物细胞工程

4.2.1定义4.2.2微生物细胞融合4.2.2.1原生质体的制备

4.2.2.2融合重组4.2.2.3原生质体再生成细胞4.2.2.4融合重组的测定微生物细胞工程微生物细胞工程

4.2.1定义：微生物细胞工程应用微生物进行细胞水平的研究与生产，具体内容包括各种微生物细胞的培养、遗传性状的改造、微生物细胞的直接利用或获得细胞代谢产物等。

4.2微生物细胞工程4.2微生物细胞工程

4.2.2微生物细胞融合细胞融合过程原生质体的制备→融合重组→原生质体再生成细胞→融合重组的测定微生物细胞工程4.2.2.1原生质体的制备酶解法①革兰氏阳性菌：溶菌酶

②革兰氏阴性菌：溶菌酶+(数分钟后）0.1mol/L的EDTA共同作用15－20min。③真核细胞：消解酶、蜗牛酶、纤维素酶、几丁质酶等处理。

微生物细胞工程4.2.2.1原生质体的制备影响因素菌体的前处理增强酶的作用效果细菌中加入EDTA、甘氨酸、青霉素和D-环丝氨酸等放线菌加入甘氨酸酵母菌中加入EDTA和巯基乙醇等4.2.2.1原生质体的制备影响因素菌体培养时间：对数生长期

酶浓度酶浓度增加，原生质体的形成率增大，过高，原生质体再生率降低。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成最佳酶浓度：原生质体形成率和再生率之积达到最大时的酶浓度4.2.2.1原生质体的制备影响因素酶解温度温度提高，酶解反应速度加快温度增加，酶蛋白逐渐变性而使酶失活。酶解时间

过短，原生质体形成不完全过长，原生质体的再生率降低。4.2.2.1原生质体的制备影响因素渗透压稳定剂保护原生质体免于膨胀有助于酶和底物的结合

KCl、NaCl等无机物和甘露醇、山梨醇、蔗糖、丁二酸钠等有机物原生质体的形成率＝原生质体数/未经酶处理的总菌数。4.2.2.2融合重组融合方法PEG诱导融合法

PEG的作用机理在原生质体之间形成分子桥

增加类脂膜的流动性

4.2.2.2融合重组融合方法PEG诱导融合法

融合技术要点4.2.2.2融合重组融合方法PEG诱导融合法PEG诱导融合的特点优点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。4.2.2.2融合重组融合方法电融合法

电融合的基本过程：细胞膜的接触：电导率很低的溶液中，电流通过原生质体极化而产生偶极子，紧密接触排列成串；膜的击穿：高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。4.2.2.2融合重组融合方法电融合法融合参数

交流电压交变电场的振幅频率交变电场的处理时间直流高频电压脉冲宽度脉冲次数

4.2.2.2融合重组融合方法电融合法优点不存在对细胞的毒害问题融合效率高融合技术操作简便

4.2.2.2融合重组原生质体的融合过程

影响原生质体融合的因素原生质体质量融合方法融合参数

4.2.2.3原生质体再生成细胞

高渗再生固体培养基中利用原生质体对渗透压的敏感性计算再生率再生频率＝（原生质体再生细胞数/总菌落数）×100%4.2.2.4融合重组的测定直接法：不补充两亲株生长所需营养物或补充两种药物

间接法:影印法复制到选择培养基上。融合频率＝融合子数/再生的原生质体数4.3植物细胞工程

4.3.1植物组织培养4.3.2植物细胞培养4.3.3植物原生质体的制备4.3.4植物原生质体培养4.3.5植物原生质体融合4.3.1植物组织培养（1）植物组织培养：是一种将植物组织、器官或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术，包括植物培养、胚胎培养、器官培养、悬浮培养4.3植物细胞工程(2)培养基大量元素：氮、磷、钾、钙、硫、镁

微量元素：铁、铜、锌、锰、钼、硼、碘、钴、氯、钠蔗糖：碳源、渗透压维生素：促进离体组织的生长植物激素：是植物细胞脱分化和再分化必不可少的调节物质有机添加物：如甘氨酸等

外植体愈伤组织新植株植物组织培养外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。愈伤组织：植物组织在离体状态下，给以一定条件，使已经分化并停止生长的细胞重新分裂生长而形成的没有组织结构的细胞团。

(3)进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：

a外植体的选择及培养。

b诱导去分化阶段。

c继代增殖阶段。