第五章光镜标本免疫组织细胞化学技术

第五章光镜标本免疫细胞化学

免疫细胞化学又称免疫组织化学，是用荧光素、生物素或地高辛等标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。一、免疫组织化学的免疫学依据抗原抗体抗原–抗体复合物＋抗原与抗体之间的结合具有高度特异性二、免疫组织化学的基本原理组织抗原标记物被标记的抗体标记抗体与组织抗原特异性结合利用免疫学中抗原与抗体特异性结合的特点以及组织化学的原理，在组织或细胞标本中加入特定的标记抗体，然后对标记物进行显示，从而对组织或细胞内的抗原物质进行定性、定位或定量研究。免疫细胞化学的突出优点是：

1.高度的特异性

由于免疫学的基本原理是抗原与抗体的“一对一”的特异结合，因此，免疫组化从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

2.敏感性高

现代免疫细胞化学采用各种有效方法最大限度保存细胞和组织内待检物质的抗原性，采用各种增敏方法，使用高度敏感的和高亲和力的抗体，保证可检出细胞内超微量的抗原分子，用显微镜和电子显微镜观察结果，因此，它是在细胞、分子水平或基因水平的检测技术。

3．定位准确、形态与功能相结合

免疫组化可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义的。

免疫细胞化学技术在细胞、染色体或亚细胞水平原位检测抗原分子，是其它任何生物技术难以达到和代替的，它能在细胞、基因和分子水平同时原位显示基因及其表达产物，形成了新的检测系统，为生物学、医学和各个领域分子水平的研究与诊断，开拓了广阔的前景。

由此可见，免疫细胞化学的基本理论是抗原抗体反应，标记化学反应和呈色化学反应。由于免疫细胞化学是在细胞和组织上进行抗原抗体反应，所以，必须熟练掌握显微标本制备的全过程，要求待检标本形态结构和抗原性保存良好，抗原不从原位扩散或丢失。所以，从事免疫细胞化学的工作者必须了解以下有关理论及掌握有关细胞和组织学技术。

有些分子本身没有免疫原性，不能引起免疫反应，但是如果把它们和某些载体分子，如蛋白质分子结合起来就有了免疫原性，就能使动物对这一复合分子产生特异的抗体。这种本身无免疫原性，但有反应原性，一旦把它与载体结合就有了免疫原性的物质，就称半抗原或不完全抗原。如寡糖，类脂和一些简单的化学物质等。吗啡就是一种半抗原，把它与蛋白分子结合起来，就可以使动物体产生相应抗体，此抗体可作为检测是否吸毒的试剂。

2.一个抗体分子有两个抗原结合点(称两价)在一个抗原分子上则可有许多个结合点(称为多价)。抗原与抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。免疫组织化学或免疫细胞化学的原理

一、分类

根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为:1.免疫荧光细胞化学技术，2.免疫酶细胞化学技术，3.免疫铁蛋白技术，4.免疫金—银细胞化学技术，5.亲和免疫细胞化学技术。不同的免疫细胞化学技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色、对照试验、显微镜观察等步骤。

二、组织材料的处理

组织材料的处理是获得良好免疫细胞化学结果的前提，必需保证要检测的细胞或组织取材新鲜，固定及时，形态保存完好，抗原物质的抗原性不丢失、不扩散和被破坏。

2.1固定液的选择

固定液的选择是免疫组化技术成功与否的基础。用于免疫组织化学技术的固定液种类较多，性能各不一样。不同抗原，其稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。所以，除要了解不同固定剂的特性外，不同的抗原和标本需经过反复试验，必要时可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。常用固定液有1.10%中性福尔马林2.4%多聚甲醛磷酸缓冲液3.1.25%戊二醛-1%多聚甲醛磷酸缓冲液4.Bouin液5.Carnoy液６.丙酮选择最佳固定液的标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构；②最大限度地保存抗原的免疫活性。

值得注意的是免疫组织化学技术中禁用含重金属的固定液。

2.2固定时间因固定液而异

组织固定时间最好在１2h内，一般固定时间不应超过24小时。随着固定时间的延长对组织抗原的检出强度将逐渐降低。

2.3固定方法的选择

常用的固定方法有两种：浸入法和灌注法。浸入法即将组织浸泡在固定液内（必要时在4℃下），固定时间根据抗原的稳定性以及固定液的性质而定，一般在2-12h之间。灌注法主要适用于动物研究，灌注固定不仅可以使固定液迅速到达全身组织充分固定，而且灌注能冲洗掉红细胞，排除过氧化物酶的干扰。

2.4石蜡切片用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规略有不同：①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽量减少组织抗原的损失；②组织块大小应＜2cm×1.5cm×0.2cm，使组织充分脱水、透明、浸蜡；浸蜡、包埋过程中，石蜡应保持在60℃以下，以熔点低的软蜡较好。

三、抗体的制备和配制

3.1抗体的制备

这是免疫细胞化学技术的首要试剂，必需制备具有很高特异性和敏感性的高效价抗体。目前国内外市场各种特异性抗体日益增多，许多实验室直接应用市售产品，现在我国自制抗体种类少，发展抗体生产十分必要。

3.2抗体的配制

包括抗体的贮存液和抗体使用液的配制方法。新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。

1.抗体分装贮存

获得新抗体后，应先根据生产厂家提供的抗体效价，将其分装，可每10ul或100ul/支分装入安瓿或0.25ml带盖塑料管中，密封。放入-20℃~-40℃冰箱中保存备用,一般可保存1~2年。小量分装的抗体可1次用完，避免反复冻融而影响效价的降低。一般用前新鲜配制使用液体，稀释的抗体不能长时间保存，在4℃可存放1~3天，超过7天效价显著降低。

2.抗体稀释

这是任何免疫细胞化学方法中最重要的一环，无论是一抗、二抗和各种标记抗体，用前都必须按不同免疫染色方法和抗原性强弱与抗原的多少，稀释使用各种抗体原液，以便获得最佳免疫染色结果。合适的抗体稀释度：抗体的浓度是免疫染色的关键，如果抗体浓度过高，抗体分子过多于抗原决定簇，可导致抗体结合减少，产生阴性结果。此阴性结果并不一定缺少抗原，而是由于抗体过量。影响抗体稀释的因素抗体的浓度抗体溶液中非特异蛋白质含量孵育时间染色方法抗体稀释的配制：

常用0.01mol/LpH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。可用以下方法配制专用的抗体稀释液，防止抗体效价下降，减少抗体在组织上的非特异性吸附：取0.05mol/LpH7.4TBS100ml，加温到60℃,再加入优质明胶100mg，搅拌溶解后，冷却至室温，加入1g牛血清蛋白，加入NaN3200mg溶解后，过滤，分装，4℃保存。

第一抗体最佳稀释度直接测定法第一抗体稀释度特异性染色非特异性染色1:50++++++1:100++++++1:200++++++1:400++++1:500++-阴性对照--第二抗体稀释度第一抗体稀释度1:5001:10001:20001:40001:100++++(++)++++(+)+++(+-)+(-)1:200++++(+)+++(-)++(-)++(-)1:400++(-)+(-)-(-)-(-)棋盘法测定第一抗体与第二抗体的最佳稀释度免疫组织(细胞)化学对照实验及结果判断标本号检测标本阳性对照阴性对照替代抗体对照结论1++--受检标本含抗原2-+--受检标本不含抗原3----操作错误4++++非特异性反应5++-+非特异性反应6+---阳性对照差

抗体的最佳稀度由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。四抗原修复（一）为什么要进行抗原修复？

组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。

(二)物理化学试剂抗原修复法

1.微波辐射抗原修复法：

它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然，光靠微波的作用是不够的，还必须依靠热的作用，方能达到目的。应用微波辐射，它有双重作用，微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热，当达到有效的温度后，就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。

1.微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。

⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

该法的特点是：产热迅速，容易操作，也容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。

2.高压抗原修复法：

该法高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。

高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

抗原修复，必须注意以下问题：

1.PH值的应用范围及选择。

应用于抗原修复的物质很多，但至今为止，大家公认的最好的抗原修复液还是柠檬酸盐缓冲液PH6.0，它适合于大多数的抗原，在常规应用的临床标记抗体中基本都适用，经用该液修复后的抗原表达增强，抗原的定性和定位很理想，结果不错。2.抗原修复时应选择最佳温度。

据Masson等研究表明：70℃－90℃的温度对没有经固定的蛋白可发生变性，但经福尔马林固定的蛋白，要使其发生变性，温度必须在92℃↑。据实验认为温度在92℃－98℃是合适的，尤其在95℃为最好，这是因为：①这种温度未达沸腾，切片不容易脱离裁片；②能够解离和破坏与蛋白交联的甲醛醛键等，处理时可以随意选择和确定抗原修复的作用时间。

3.抗原修复液必须遵循自然降温规律，否则效果不好或达不到抗原修复的目的。

抗原修复持续时间过后，取出放于室温中让其慢慢地降温，决不能为了争取时间，强行用冰块或冷水令其降温。这是因为当高温中的抗原蛋白分子链脱离了其它的束缚或联结，要有一个自然环境让其自然放松下来，随着温度的降低，它们会慢慢地恢复原来的形态和构型。如果用冰块和冷水强行令其降温，松开后的蛋白分子肽链突遇降温而固定下来，恢复不了原有的构型，达不到预想的效果。

4.尽量使用足量的抗原修复液。

抗原修复的方法，都采用加热的方法，尤其是微波辐射加热法，该法由于产热快。液体容易挥发直至干涸。因此，应用于抗原修复的液体，一定要充足，防止切片干涸。用于抗原修复的切片，如果由于液体少而导致切片的干涸，则应丢弃切片，因为热干涸的切片中的抗原是没办法补救的，因它是一种不可逆的现象。（二）化学试剂抗原修复法：

1.胃蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④PBS洗3次，1分钟/次。

⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。

⑥PBS冲洗3次，2分钟/次。

⑦后按选择好的免疫组化该法进行染色。

2.胰蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④PBS洗3次，1分钟/次。

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。

⑥PBS洗3次，2分钟/次。

⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。

总而言之，正确选择抗原修复法，可按如下流程进行。

首先，在对抗体不熟悉的情况下，我们可先不作任何修复，直接进行免疫组化的常规操作，然后与阳性片作对照，如能达到相似或相近的效果则说明无需进行修复，如出现阴性则可进入下一步;第二，对标本进行化学性修复操作，如仍为假阴性则可进入下一步;第三，物理/化学性修复，在此，笔者强烈推荐高温高压修复法。虽然该法较之微波法和超声波法麻烦，但效果明显，定位更准确，假阴性出现的几率最小。

五改善细胞通透性

在染色前对组织切片或细胞标本需要处理，以改善细胞的通透性．因为，当待检测的抗原存在于细胞内或细胞膜有细胞衣时，大分子的抗体就很难透过细胞的质膜或细胞衣顺利结合到抗原上．因此，对涂片，组织培养标本和组织切片标本等细胞抗原进行免疫组织（细胞）化学染色前，必须改善细胞膜的通透性，使大分子抗体容易透过．改善细胞通透性一般采用净化剂１％三硝基甲苯的0.01mol/LPBS液,将此液作用组织样本10-15分钟

六、对照

其目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问。主要是针对第一抗体对照，常用的对照方法包括：①阳性对照；②阴性对照；③空白对照；④替代对照；⑤阻断试验；⑥自身对照；⑦吸收试验。①阳性对照

用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。

②阴性对照

用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照，是阴性对照的一种。其实空白、替代、吸收和抑制试验都属阴性对照。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。③空白对照

是最常用的对照，用不加一抗的缓冲液，如PBS替代一抗，染色结果应为阴性，说明染色方法可靠，可排除组织的内源性过氧化物酶、碱性磷酸酶、自发荧光等物质引起的非特异性显色④替代对照

用与第一抗体来源的同一动物免疫前血清，如第一抗体用的是兔抗人GFAP的IgG抗体，对照中用非免疫性的正常IgG血清来替代一抗，以相同的稀释倍数进行对照染色。这可证明待检切片中阳性结果不是抗体以外混杂的血清成分所致，而是所用特异性抗体与组织细胞内待检抗原的特异性反应的结果。⑤吸收试验对照

用过量已知相应的纯化抗原与第一抗体反应，抗体结合点全部被抗原结合，这种被抗原吸收的抗体不能再与组织内的抗原反应，故再做免疫组化染色时，结果应为阴性。⑥自身对照

用同一组织切片上与待检抗原无关的其它结构做对照。阴性反应与阴性结构同在一个视野中，相互印证，这本身就是对阳性反应的特异性对照。但进行科研工作中，单纯用这种对照是不科学的。必须增加如空白对照、替代对照等，才能使染色结果得到承认。

六、免疫细胞化学结果的判断

对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证

特异性染色与非特异染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布有细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布，常为某一部位成片的均匀着色。细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。

非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。

减少或消除非特异性染色的方法

组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20)封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入2%~5%牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为10~20min。也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清(非免疫的)。有明显溶血的血清不能用，以免产生非特异性染色。

免疫荧光染色时，可用0.01%伊文氏兰(PBS溶液)稀释荧光抗体，对消除背景的非特异性荧光染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的第一抗体是最重要的条件。洗涤用的缓冲液中加入0.85%~1%NaCl成为高盐溶液，充分洗涤切片，能有效的减少非特异性结合而减少背景染色。

㈠阳性细胞的染色特征

免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。

⑴阳性细胞染色分布有三种类型

①胞浆；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。⑵阳性细胞分布可分为灶性和弥漫性。

⑶由于细胞内含抗原量不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。⑷阳性染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。⑸切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。免疫荧光组织(细胞)化学方法1.直接法

用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。简便、快速、特异性强、非特异性背景反应低敏感性低，难以检测抗原量少的样品2间接法先用特异性第一抗体与标本上相应抗原结合,