植物分子育种学

植物分子育种学的概念运用分子生物学技术的科学性与先进性，即可以将不同物种的遗传物质（DNA或基因）导入受体细胞，再进行培育与选择，从而育出符合育种目标要求的新品种。植物分子育种可概括为三个层次上的工程技术：1.将带有目的性状基因的供体总DNA片段导入欲改良的植物受体细胞，使其后代发生变异，从中筛选出获得目的性状的后代或符合需要的有价值的新类型，培育出高产、优质、高抗的新品种；2.分离目的基因，构建重组分子，导入需要改良的植物受体细胞，经过筛选，培育出获得目的性状，且综合性状优良的后代，育出新品种。3.分子标记层次。植物分子育种的特点1、 打破物种分类的界限，充分利用自然界丰富的遗传资源，使遗传物质能在不同的植物间，甚至在植物、动物和微生物之间进行交流；2、 利用植株的特定细胞进行外源DNA或基因的转移，如卵细胞、受精卵或早期胚胎细胞；或者幼胚、幼苗、芽丛分裂旺盛的细胞，它们随着整体生长发育的进程而完成外源DNA或基因的导入、整合与转化过程。无需经过细胞原生质体离体培养、转化诱导，形成再生株等一系列繁琐复杂的培养流程。3、 适应面广，单子叶、双子叶植物均可运用这项技术达到品种创新与改良的育种效果。4、 与常规育种相比，育种时间明显缩短，一般只需3〜4代各选系便可稳定。5、 方法简便，室内外（大田、盆栽场、温室等）均可进行，常规育种工作者易于掌握。周光宇提出的“DNA片段杂交”假说：就整体分子而言，远缘亲本间的染色体结构是不亲和的，容易相互排斥。但局部DNA分子部分基因间的结构有可能保持一定的亲和性，因而远源DNA片段有可能进入受体细胞。在母体DNA复制过程中，这种DNA片段便与受体基因组相应区段整合，成为子代所表现的各种典型或非典型遗传变异现象的内在遗传依据。DNA片段杂交假说的分子验证1、 同工酶分析：在高粱稻（银坊X亨加利）及其亲本酯酶同工酶分析研究中发现一条与高粱相同而银坊（母本）没有的酶带，说明高粱稻中的这条酶带来自父本高粱；2、 DNA分子杂交：在对高粱稻基因组的分析研究中，取父本高粱DNA与母本水稻DNA进行分子杂交，除去两者的同源序列，以其余的高粱DNA序列制备探针，与高粱稻DNA进行分子杂交，发现高粱稻DNA中存在高粱的同源序列，从而证实高粱稻基因组中确实存在高粱DNA片段，此即说明高粱DNA片段已整合于高粱稻的基因组中。3、 DNA复性动力学分析：在对高粱稻及其两亲本的重复序列DNA复性动力学分析研究中，发现高粱稻基因组的中度重复序列部分与母本水稻有差异，从而进一步说明这是由于父本高粱稻DNA整合于母本水稻基因组而造成的结果。外源DNA的导入是指通过某种特定的途径将外源基因或外源DNA片段导入受体细胞，使之整合到受体细胞基因组中，而实现其功能表达的过程。外源DNA导入植物细胞三个关键因素：一、有适宜的基因（包括目的基因、选择标记基因或报告基因）和合适的选择条件；二、组织培养体系，要求植物细胞必需有效的再生成株，频率高，周期短；三、外源基因导入到植物的途径和方法，要求损失小、频率高且外源基因能稳定的整合到基因组，并且具有正常的时空表达能力。外源DNA导入方法：一、 按照技术属性可将它们分为物理法、化学法、生物法。1、 物理法：基因枪法、电激法、微注射法、激光穿刺法、超声波法、碳化硅纤维法等；2、 化学法：聚乙二醇（PEG）法、磷酸钙一DNA共沉淀、脂质体法等；3、 生物法：农杆菌介导法、花粉管通道法、浸渍法、病毒介导法等。二、 按照媒介类型的有或无，可分为载体介导法、直接导入法和种质系统介导法：1、载体介导法：将目DNA转入农杆菌或病毒中，并以之为载体，随着它们对植物的感染而将目的DNA导入植物细胞中；2、直接导入法：以裸露的外源DNA通过化学或物理方法直接导入植物细胞；3、种质系统介导法：借助植物自身的种质细胞与媒介（如花粉、子房、花粉管通道、幼胚等）来实现外部NA导入，它包括花粉管导入法、子房、幼穗、幼胚注射法、种子浸渍法等。一、农杆菌介导法又包括：（1）创伤植株感染法（又叫做整株感染）（2）原生质体和农杆菌共培养法转化植物细胞（3）叶盘法转化植物细胞。目的基因通过这种方法进入植物细胞要分几个步骤走：第一，将目的基因重组到适当的Ti质粒载体或Ri质粒载体或其它类型的载体上。根据所选用的载体系统进行重组。重组方法就是基因工程中常用的一些基本方法。第二，目的基因随载体进入农杆菌（即转化农杆菌）。1）直接转化法；2）三亲交配法。第三，目的基因进入植物细胞，即植物细胞的转化。根癌农杆菌获得了外源目的基因后，接下来的工作就是要转化给植物细胞。（原理）：农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，它们侵染植物后能诱发植物形成肿瘤。从一种致癌的农杆菌中分离出了一种巨大质粒（约200Kb），称为致癌质粒，简称Ti质粒。Ti质粒上有一段DNA被称为转移DNA（简称T—DNA），能转移并整合到植物染色体上，其上携带的基因能在受体细胞中表达。Ti质粒随后被改造用作人工植物基因工程的载体。这种利用农杆菌的遗传转化体系，将外源目的基因或DNA片段插入Ti质粒的T-DNA中，并随之导入受体植物细胞，而获得转基因植株的方法，即为农杆菌介导法。（操作步骤）植物受体系统的建立；Ti质粒转化载体系统的构建；工程农杆菌的制备；外源基因的转化；转化体的筛选和转基因植株的检测二、 基因枪法又称微弹轰击法、粒子轰击法、高速粒子喷射技术、弹道微靶点射击，是一种借助高速金属微粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。（原理）利用火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将载有外源DNA的金（或钨）粉等金属微粒加速，射入受体细胞或组织，从而达到将外源DNA分子导入细胞中的目的。（操作步骤）1、受体细胞或组织的预处理。通过渗透剂（甘露醇、山梨醇等）处理来调节受体细胞或组织的渗透压，维持细胞的高渗状态，使其在轰击受伤后细胞质的外渗减少，从而有利于细胞的成活。2、DNA微弹的制备。这一过程是将外源基因DNA分子以一定比例附着在金属微粒子（金粉或钨粉）载体上。3、受体材料的轰击。4、过渡培养与筛选培养。轰击后的材料先在不含选择压力的培养基中过渡培养一段时间（一般1〜2周），以利于受轰击材料的恢复并充分表达外源基因（包括选择压力抗性基因），再转入有选择压力的培养基中进行培养，以抑制非转化细胞的生长，而转化细胞则能继续生长分化，从而被筛选出来。三、 聚乙二醇法（原理）聚乙二醇（PEG）是一种选择性化学渗透剂，它可以使细胞膜之间或使DNA与细胞膜之间形成分子桥，促使相互间的接触和粘连，并通过改变细胞膜表面的电荷，引起细胞膜透性变化，从而促进外源大分子进入原生质体，因此称之为PEG诱导法。（操作程序）1、分离原生质体；2、提取带有目的基因的质粒或其它外源DNA；3、取0.5ml新制备的原生质体悬浮液（原生质体密度为2X106/ml）,加入50pl小牛胸腺DNA，混匀后静置10分钟，然后再加入10ml外源DNA，轻轻混匀后静置10分钟；4、加入等体积40%的PEG溶液，立即混匀，室温下置30分钟；5、每隔5分钟加1〜2ml0.2mlCaCl2溶液，逐步稀释到10ml；6、离心收集原生质体，并重新悬浮培养到10ml培养基中培养1周；7、将原生质体转移到选择培养基中进行筛选培养。（基本特点）PEG法的优点如下：1.实验成本低，不需要特殊的仪器设备；2.受体植物材料不受种类的限制，只要能建立原生质体再生体系的植物都可以采用此法；3.得到的转化体中嵌合体很少；4.结果稳定，重复性好；5.有实验证明，此法可使两个非连锁基因的共转化率达50%左右；6.有研究表明，用植物总DNA进行转化，其转化频率与用质粒DNA接近；7.此法可与电击法、脂质体法、基因枪法、激光微束穿刺法等技术结合使用，可大大提高转化率。PEG法也有较大的局限性：1.必须以原生质体为受体，而建立原生质体再生体系往往十分困难；2.转化率仍然偏低。四、 浸渍法（基本原理）浸渍法是将植物的种子、胚、胚珠、子房、花粉粒、幼穗、悬浮细胞甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用植物细胞自身的物质运输系统将外源DNA分子直接导入受体细胞。现在已经证明植物细胞至少通过以下几种途径将外源DNA吸入细胞内：1、外源DNA可以通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化的运输系统而被运输到每一个细胞内；2、植物细胞通过类似于动物细胞的内吞作用将外源DNA摄入细胞内；3、植物组织中的传递细胞的膜透性改变可以为大分子物质透过细胞膜提供机会，尤其是生殖细胞以及分生细胞中，外源DNA进入细胞中的机会更大。（基本方法）以种子为受体介绍其基本操作方法：1、 将种子用0.1%的升汞或20%〜30%次氯酸钠消毒，无菌剥去种皮（也可剥去幼胚）；2、 将剥出的种子浸于无菌的0.1XSSC缓冲液中，加入20%的二甲基亚砜（DMSO）；3、 加入供体DNA溶液（100〜200pg/ml），浸泡30min至数小时；4、 用无菌0.1XSSC缓冲液冲洗干净；5、 将种子放在无菌滤纸上吸干水份后，转入无激素的固体培养基上培养；6、 将生长发育正常的胚转入筛选培养基上进行筛选（用质*^NA浸泡的种子），或成苗后转栽到土壤中进行变异性状分析（用总DNA浸泡的种子）。（基本特点）浸渍法具有如下优点：浸渍法是高等植物转化技术中最简单、快速、便宜的一种转化方法，它无需昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，容易推广。局限性如下：转化频率较低，重复性较差，筛选和检测也困难，往往很难得到分子生物学证据。五、 花粉管通道法（原理）在受精及胚胎发育的初期是植物接受远缘遗传物质的敏感时期，就生殖细胞的结构而言，在胚囊中的精、卵细胞类似天然的原生质体；而且在精子入卵时，卵膜有一个开闭的过程；即使到了合子期，胞壁的形成也尚未完备，胞壁的屏障作用还很小，因此外源基因进入受体卵细胞及合子的阻力较小。在花粉管伸入胚珠的过程中可形成花粉管通道，这为外源DNA分子进入胚囊提供了天然的途径。植物授粉后外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎。就整体分子而言，亲缘关系愈远的生物间的染色体基因DNA的结构愈不易亲和，而容易相互排斥，但从局部的DNA片段来看，两种来源的DNA在部分区段上可能保持一定的亲和性，因而远缘DNA片段在受体细胞DNA复制过程中有可能被重组进去，这便是染色体水平以下的分子杂交。（操作方法）柱头切除法：当受体植物自花授粉一定时间后（一般2〜3小时），切去花柱，然后马上在切口上滴入供体DNA溶液（浓度为50-100Pg/ml，溶于1XSSC），最后套袋隔离至种子成熟。花粉粒吸入法：收集新鲜花粉加入到供体DNA溶液中混匀，使外源DNA吸入花粉粒，然后取混合液滴于预先去雄套袋隔离的雌花上进行人工授粉，再继续套袋至种子成熟。柱头涂抹法：在未授粉前先用DNA溶液涂抹柱头，然后人工授粉套袋隔离，通过花粉管的伸入将外源DNA带入胚囊，成熟后收获种子。（基本特点）无需细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等一整套人工培养过程。避免了原生质体再生以及组织培养过程中可能导致染色体变异或优良农艺性状丧失的问题。不受植物种属的限制，在具备有性生殖过程的任何植物上都能应用。简便，易于掌握，可以在大田、棚栽或温室种进行。育种时间短，筛选遗传稳定的品系一般只需3〜4代时间。通过外源总DNA片段的导入可以了解一些具有重大经济价值的农艺性状是否能够通过DNA片段进行转移，这些性状是单基因性状还是多基因性状，从而能为目的基因的克隆提供参考和材料。六、 超声波导入法（原理）超声波是指频率为2X104〜2X109Hz的声波。它的生物效应主要是机械作用、热化作用和空化作用，导致细胞壁与细胞膜的击穿或可逆的通透性的变化，这将使得外源DNA进入细胞中。（操作程序）1、受体材料的培养：一般采用无菌苗的不同器官、愈伤组织或原生质体，按常规方法进行培养。2、提取外源DNA：所用质粒DNA或外源总DNA均按常规方法提取和纯化。3、 超声波处理：将受体材料切成小块，放入超声波小室中，加入2〜3ml超声缓冲液，同时加入20pg/ml供体DNA及40pg/ml鲑鱼精DNA，超声波处理的声强为0.5〜2.0W/cm2，处理时间为10〜50分钟。4、 处理后受体材料的培养和筛选：处理后将受体材料从缓冲液中取出，在正常培养基上恢复生长1周后，转入到选择培养基上进行筛选。（基本特点）优点：1、不受受体种类的限制，不仅适应于原生质体，而且适用于带壁细胞的转化；2、操作简单，转化效率高。缺点：外源DNA用量大，许多参数有待于优化。七、 激光微束法（原理）激光是一种很强的相干单色电磁射线，一定波长的激光束经聚焦后到达细胞膜表面时其直径大约只有0.3〜0.5nm。这种直径很小、能量很高的激光束可以使细胞膜产生可逆性穿孔，利用激光微束的这种穿孔效应可以使外源DNA导入到受体细胞中。（操作程序）1、 受体材料的预处理。将欲处理的材料（幼胚、愈伤组织、悬浮细胞等）转入高渗缓冲液（10mmolTris-HCl,0.7mol山梨醇或甘露醇、pH7.2），浸泡1〜5小时，然后用新鲜培养液洗去高渗液，将受体材料移入激光机的样品处理室中，加入0.5ml培养液，加入浓度为5pg/ml的外源DNA50pl混匀，并设不加DNA的对照。2、激光微束照射。3、受体材料的培养：照射后的受体材料按照常规方法进行培养。（基本特点）优点：1、是一种物理转化方法，无受体材料限制，适用于各种功能植物材料和各种类型的受体细胞；2、操作简单、方便、转化效率较高；3、还可进行细胞器的基因转化，由于激光微束小于细胞器，它可以在亚显微水平上直接对细胞器穿孔，实现外源DNA对细胞器的转移。缺点：1、需要昂贵的仪器设备，转化频率只有10-3-10-4；2、 其稳定性和安全性目前还不如电激法和基因枪法。八、 其它转化方法一、 脂质体介导法脂质体介导法是用脂类化学物质合成人工脂质膜，把外源DNA分子包裹在膜内形成脂质体，然后通过植物原生质体的吞噬或融合作用把内含的DNA转入到受体细胞中。脂质体是由磷脂组成的膜状结构，用它包装外源DNA分子，然后与植物原生质体共保温。于是脂质体与原生质体膜结构之间发生相互作用，尔后通过细胞的内吞作用而将外源DNA高效地纳入植物的原生质体。这种方法具有保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应，适用的植物种类广泛，重复性高包装在脂质体内的DNA可稳定地贮藏等优点。二、 病毒介导法将病毒基因组中对病毒繁殖非必需的一段核苷酸序列去掉，换上一小段外源DNA，而不影响病毒基因组正常的包装，病毒侵染植株或组织后，可通过系统感染把外源基因转移到细胞。三、 电泳转移法借在一定电场强度下由负极向正极泳动的DNA泳动力，将DNA引入到靠正极端的受体组织细胞中。细胞壁是以纤维丝为基质而组成的，含有许多小孔，在电场中DNA迁移可通过细胞壁的小孔，并可通过质膜而进入细胞。四、 转座子介导法将植物内源转座子分离出来，构建在含有目的基因的表达载体上，并通过适当的方法将之导入到受体细胞中，利用转座子的转座功能，可将其邻近的目的基因转移到受体细胞的染色体上，即可实现外源基因的有效整合与表达。目的基因：基因工程中克隆的目标DNA分子，是一段特异序列的DNA片段。目标基因克隆的方法：利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库；利用基因差异表达获得目的基因。PCR扩增获得目的基因或cDNA（一） 引物设计：利用引物分析软件；2.根据扩增序列，在其两端各选取5端一段序列。3.在引物的5端添加限制性内切酶的识别位点及保护碱基以方便克隆。（二） 引物效果检验和PCR参数确定PCR主要参数确定：退火温度Mg2+ 反应时间循环次数常规PCR衍生的几种基因克隆技术：（一） 反向PCR（inversePCR）（二） 热不对称交错PCR（thermalasymmetricinterlacedPCR,TAIL-PCR）（原理）根据目标序列的侧翼已知序列设计3个嵌套的特异引物（sp1,sp2,sp3,约20bp），用它们分别和一个具有低Tm值的短随机简并引物（arbitrarydegenerateprimer,AD,约14bp）相结合，以基因组为模板，根据引物长度及特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。TAIL-PCR分三轮反应。（三） 从mRNA中扩增:RT-PCR（1）提取基因组totalRNA（2）反转录合成总cDNA作模板（3）根据目的基因序列设计引物（4）PCR扩增（四） 锚定PCR（五）cDNA末端的快速扩增构建基因组文库或cDNA文库（原理）根据基因编码蛋白的同源性或者多个同源基因cDNA比较的变异情况，将同源性基因cDNA的核心区段分析出来，针对核心区段保守性高的位点设计引物，然后运用RT-PCR先扩增和克隆核心序列区。在测定核心序列后，根据核心序列设计新的引物并分别进行cDNA3,端和5'端的扩增。最后拼凑成cDNA全序列的信息并设计新的一对引物将其RT-PCR扩增并克隆。基因文库（Genelibrary）——通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。基因组文库（Genomiclibrary）——将某一生物基因组DNA全部克隆后获得的重组子群体的总称。cDNA文库（cDNAlibrary）——将某生物特定的组织器官或发育时期的全部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表达基因的产物。（构建意义）通过基因文库的构建贮存和扩增特定生物基因组的全部或部分片段，保存物种遗传种质。从基因文库中调出其中的任何DNA片段或目的基因。构建基因文库是研究基因本身的需要，如基因结构的分析、基因表达和调控的研究等。基因组文库的类型：质粒文库、噬菌体载体文库、粘粒文库、细菌人工染色体文库和酵母人工染色体文库。构建基因组文库应满足的条件：基因组文库的完备性：是从基因组文库中筛选出含有某一目的基因的重组克隆的概率。基因组文库的大小：1）基因组的大小；2）克隆片断的长度；3）从中分离特定基因的置信度。N=1n（1—P）/ln[1-L/G]式中P为期望概率，L为单个重组体的DNA片段的长度，G为基因组DNA的总长度。N是所需要的重组体数目基因组文库的构建：（一） 基因组DNA的分离制备：原核细胞的基因组包括其拟核的DNA和附加的遗传体系如质粒DNA，真核细胞的基因组包括其核基因组及细胞器如线粒体和叶绿体的DNA。质量必须满足：1.结构具有相对完整性；2.尽量排除其它大分子成分的污染（蛋白质、多糖及RNA等）；3.保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及离子等。（二） 基因组DNA的片段化：限制性内切酶对DNA分子的酶解。两种方式：DNA完全酶解和DNA不完全酶解；DNA完全酶解DNA分子的物理剪切运用识别4对碱基的限制性内切酶制备随机性DNA片断，具有了较高的随机性，但相对随机性更高的方式还是运用不依赖碱基序列的物理剪切方法。选择合适的构建基因组文库的载体：1）要求有较大的克隆容量；2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等的转化效率；3）在重组子进行扩增时，扩增的机会相近；4）可以较方便地进行文库的筛选。基因组文库构建的常用载体：Lambda噬菌体载体、cosmid、BAC及YAC。（三）载体制备；（四）重组连接：制备出的适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂一插入分子一右臂的分子重组。构建文库时重组连接常采用相同粘性末端的连接，以替换型载体构建基因组文库多采用BamHI酶切末端与插入外源DNASau3AI末端的互补连接。（五）噬菌体离体包装；（六）重组噬菌体转染大肠杆菌。基因组文库的扩增筛选：lambda载体的基因组文库是以噬菌斑的形式获得重组噬菌体的集合；cosmid载体的基因文库是存在于细菌中的大分子重组质粒，以独立的转化菌落形成集合；BAC文库也是以细菌菌落形式存在；YAC文库则以酵母菌形式出现。噬菌体文库的扩增可以通过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后的产物。用缓冲液将这些噬菌斑中的病毒洗脱下来，便获得了扩增后的文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C可以保存数年。粘粒载体、BAC和YAC文库，则对转化的菌落单独编号、扩增和保存。染色体步移（chromosomewalking）当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。（原理）是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分（注意不能包含重复序列）作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分（即探针序列）是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛选文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。cDNA文库的优越性：1、 cDNA克隆以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒，例如流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。2、 cDNA基因文库的筛选比较简单易行。3、 每一个cDNA克隆对应于一种mRNA序列，假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因的序列。4、 cDNA克隆可用于在细菌中表达基因的产物。cDNA文库的大小：cDNA基因文库大小的估算公式N=ln（l-P）/ln（l-f）N为cDNA基因文库必需的克隆的数目；P为文库中含目的基因cDNA片段的出现概率，一般情况下，期望值为99%；f是某种mRNA的丰度。cDNA文库的构建：cDNA文库构建的载体。cDNA是由mRNA反转录获得的互补DNA，分子大小通常分布在0.5kb—10kb间。cDNA的获得。A、分离mRNA；B、对mRNA进行富集；C、cDNA的合成；D、粘性末端片断与载体的连接；E、离体包装获得重组噬菌体。文库的筛选：筛选文库即指从文库克隆的群体中将特定的克隆选择出来的过程。1、运用氨基酸序列信息进行cDNA文库筛选；2、运用标记抗体对cDNA文库进行筛选；3、分子探针杂交的方法，通过分子杂交后的信号，将与探针特异结合的克隆钓取出来；4、运用PCR方法进行cDNA文库筛选。分子标记的定义是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比， DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在 DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的种类：形态标记、细胞学标记、生化标记。形态标记：遗传学上稳定、可见的外部特征遗传与环境、结构基因与调控基因综合作用的结果。如穗形、芒长、穗长、粒色、穗形、矮秆、卷叶等。特点：直观简单。从基因型到表现型存在基因表达、调控、个体发育等环节，表型差异有时难以反映基因型差异。细胞学标记：染色体数目变异及结构变异，表现在染色体核型（数目、大小、随体、着丝点位置等）和带型C带、N带、G带等）。随着分带、细胞原位杂交等研究技术的发展，可在染色体水平揭示更多遗传变异。特点：直观、快速而经济，但变异十分有限，当染色体数目形态相似时难以分辨。生化标记一一贮藏蛋白和同工酶：特点：经济、方便、成本较低。结构基因表达产物，对非结构基因无能为力；所检测位点只是基因组一部分；数量有限，有时受发育时期和环境影响。分子标记特点（本质是以核苷酸序列作为标记）（1）不受季节、环境、基因表达与否的限制；（2）多态性高，存在着丰富的等位变异；（3）数量丰富，多态性遍及整个基因组；（4） 表现为“中性”，不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；（5） 许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂合基因型，提供完整的信息。分子标记在遗传育种中的应用：1、分子图谱的构建。2、品种、品系鉴定和杂交种纯度分析。3、亲缘关系分析。4、基因标记及标记辅助育种。5、数量性状基因位点（QTL）的分子标记辅助选择。植物分子育种目标：一、 高产。高产是一个动态的概念，对于高产的要求是随着育种技术进步而不断发展的。如何实现育种提出的高产目标，在育种中就是要将合理的株型与优良的生理功能相结合。合理的株型，就是指叶片在茎、枝上的着生姿态与分布，叶片合理配置，以最有效地利用光能，制造更多地营养物质，增加产量。二、 优质。农产品的品质是我国农业生产上一个比较突出地问题。在市场经济条件下，产品地质量决定在竞争中地胜负，而且关系到加工工业的发展，人民的健康和环境保护。不同作物，因其用途不同，对优质的具体要求就各不相同。例如稻米要求外观好看，整精米率高，米饭食味好等；麦类要求出粉率高等。三、 多抗。多抗是农作物稳产的重要保证，是减少各种自然灾害损失，降低生产成本，降低农药残留量，保护生态环境必须具备的特性。要求一个品种具备各种抗性是很难做到的。一般来说，在高产优质的基础上，能抗当地的主要病虫及重要的自然灾害就是很大的成功。因此，在多抗性育种目标上，应抓住当地的主要矛盾，突出重点，才能获得较显著的成效。四、 其它目标。适宜的成熟期：适宜的成熟期就是能充分利用当地的光、温、水资源，达到全年（包括一季或多季）最高产量的目的。适合机械化栽培管理：如株型紧凑，秆硬不倒，生长整齐，株高一致，成熟一致，不落粒等。制定育种目标的原则：一、 树立发展和超前的意识。一个新品种的育成和推广一般需要5〜8年，因此在制定育种目标时，必须具备发展和超前的观点。在这段时间内农业生产条件、农产品加工工业对作物品种的要求，人民生活水平提高对农产品要求等的变化都必须考虑。二、 抓住当地生产中主要矛盾。育种是在具体的地点与具体的时段内进行的，因此，必须根据当地这个时期现有品种的生态特点，针对限制生产的主要问题，找出有关的主要目标性状，选育出能克服现有品种的缺点，而保持其优点的新品种。三、要有市场经济的观点。在市场经济条件下，农产品最终都以商品进入市场，经济效益由市场销售量与价格决定。

所以，越是市场需要的产品，价格越高，效益随之增加。市场价格取决于产品的质量，所以优质与高产是同样重要的。四、 要注重环境保护。环境保护是一个世界性的问题，育种工作者也应该义不容辞地承担起这个任务。从育种工作来看，选育生长期中抗病虫品种，可以减少施用农药，减少环境污染，降低农产品的残毒含量。同时，使农产品本身不含有毒物质，如无棉毒素棉花品种的选育。此外，农产品在储藏期间的品质变化往往会产生一些有毒物质，如花生在储藏期产生黄曲霉素，因此，选育耐储藏的品种也应该作为育种工作者的任务之一。五、 要明确选育对象的具体性状。高产、优质、多抗等是总的育种目标，但如何实现却是很具体的，如果不落实到具体性状上，就变成泛泛而谈了。植物分子育种选择的基本方法：1、 单株选择法。在原始群体（分子育种中是导入外源DNA的后代）中选择优良的个体（单株、单穗或单铃），分别收获、脱粒、保存、编号，第二年分别播种成行，种子量多时可种成小区，根据植株表现进行比较，鉴定上年当选个体的优劣，将不良个体的后代淘汰。单株选择的次数取决与后代的表现。凡经过单株选择的后代性状表现整齐一致的，就不再进行选择。2、 混合选择法。从供选择的群体材料中，按一定的经济性状和特性分成若干类型，选择各种类型中的优良个体，按类型混合脱粒，下年混合种植，并与原品种比较。性状鉴定：1、直接鉴定和间接鉴定直接鉴定：根据某性状的直接表现评定该性状的优劣，称为直接鉴定。如株叶形态、穗形、出油率、出粉率等。间接鉴定：有些生理性状和品质性状不易进行直接鉴定或鉴定费用高时，可根据相关变异或性状连锁原理，借助另一些性状与被鉴定性状的相关关系，间接推断所需鉴定性状，称为间接鉴定。例如，水稻秧苗的抗寒力与束缚水和可溶性糖含量有关，含量高的抗寒力强。2、 自然鉴定和诱发鉴定自然鉴定：当自然条件下所需的鉴定条件经常发生，并使作物该项性状得以充分表达时，便可以在田间条件下进行鉴定，称为自然鉴定。诱发鉴定：当鉴定所需条件不是经常发生的，如病害、虫害、冷害、干旱等，就必须人工模拟、创造条件，诱发性状出现，称为诱发鉴定。如接种病原菌进行鉴定。3、 当地鉴定与异地鉴定当地鉴定：在当地条件下能满足某些特性鉴定的要求，可在当地鉴定，称为当地鉴定。异地鉴定：在当地不适合某些性状的充分表达，二人工诱发条件又不太容易和不便于模拟时，便需将材料送到其它适宜的地方种植、鉴定，称为异地鉴定。各世代材料的种植方法：（1） D1代的种植方式。总的原则是D1代是将导入所获得的种子全部种下去，因为通过导入所获得的种子数量较少，其种植的方法可分为两种：一是将所获得的种子按组合混合种植；二是导入的材料较多时，可以按组合分株（单穗、单铃）种植，这是因为有时在D］代表现变异，可以提早进行选择。（2） D2代的种植方式。一般是按组合材料组成群体，种植的数量较多，混合种植D1代混合收割、脱粒、保存，作为d2代的种植材料，要特别注意的是在这种d2代时要种植受体亲本作对照，在有条件的情况下，也应种植供体亲本。（3） D3的种植方式。D3代的种植材料是从D2代中的选择的单株或单穗，所以应按组合分单株种植，其规模的大小取决于d2代选择单株或单穗的数量，同时也应种植通用的对照和原受体对照。（4） D代种植方式。一、若D1代稳定，各项性状整齐一致，表现优异，则进入鉴定苗圃；二、若D1代还有分离，则应继续选择单株和单穗，作为D的种植材料。如此反复选择，直到各项性状稳定为止。 "选育技术：通过外源DNA导入获得的变异材料是比较容易的，但要育成符合育种目标的新品种，就要进行选择，选择是育成新品种的关键，其中田间选择是必不可少的。田间选择的一般方法是:“先选系，后选株'。田间选择重要由感官鉴定来完成，考察的项目是：一、 生育期。如禾谷类的始穗、齐穗、成熟期，棉花的现蕾、现花、吐絮期等。二、 株型。叶片大小、着生姿态、茎蘖的集散程度、株高等。三、 产量性状。如单株成穗数的多少、穗子大小、着粒密度、结实率、铃大小、成铃率等。四、 品质性状。稻米的粒形、垩白的大小及有无、棉花纤维长度与长度的初步鉴定等。五、 生长情况。如整个生长期是否正常、是否有病虫害的发生、严重程度、当发生某些灾害性天气后，植株授是否受害及严重程度，如开花期正遇到连续阴雨天，开花是否正常；早稻秧苗期遇到低温阴雨，秧苗生长是否正常。性状鉴定与选育：（一） 、抗病性。常用的抗病性鉴定有田间鉴定与室内鉴定、成株鉴定与苗期鉴定、离体鉴定1、 田间鉴定与室内鉴定自然条件下的田间鉴定是抗病鉴定的基本方法，但它易受气候的影响。田间鉴定一般需要设病圃，在病圃中要均匀的种植感病材料作为诱发行；供试的材料中还要设改感病和抗病对照，等距离种植，以检验全田发病是否均匀，作为确定抗性级别的参考。2、 成株鉴定和苗期鉴定有些作物品种在成株期和苗期的抗病性表现不一致时，要在苗期和成株期分别进行鉴定。3、 离体鉴定离体鉴定是采取供测定的样本植株的枝条、叶、分蘖等进行离体的培养，然后人工接种。其优点是鉴定速度快，可同时分别测定同一材料对不同的病原物或不同小种的抗病性，尤其是对正在生长中的任一单株进行测定，不会妨碍它的结实。（二） 、抗虫性。以远缘亲本或近缘亲本作物外源DNA供体是为了确定抗虫性是否转入受体或需要选育抗某种虫害品种时，就必须进行导入后代的抗虫性的鉴定才能有效的进行选择，淘汰不具抗性的材料。抗虫性鉴定的方法常用的是田间鉴定和室内鉴定。1、 田间鉴定。（1）采用的方法：①在大面积感虫的作物或品种中设置试验。②在测试材料中间种感病品种，利用引诱作物或诱虫剂，把害虫引入鉴鉴定小区。③用特殊的杀虫剂减少天敌，而不杀测试害虫等来维持适当的害虫群体。（2）指标。田间鉴定的指标，依作物受害方式、部位、发育阶段的不同而异，包括死苗率、叶被害率、果实被害率、枯心率等。害虫的某些参数如产卵量、虫口密度、死亡率等。2、 室内鉴定。室内鉴定同样可以选择植株受害后的表现或昆虫个体或群体的增长速度作为反映指标。它的最大的优点是条件比较容易控制，但局限性也很大，不能够取代田间鉴定。（三） 、抗旱性。抗旱性的鉴定方法有直接鉴定和间接鉴定两种：1、直接鉴定。在田间干旱田间下，或设置旱地和水浇地，或用装有不同水份含量土壤的盆钵，观察品种间的性状表现和产量的高低，借以鉴定品种的抗旱性。2、间接鉴定。通过测定某些与抗旱性密切相关的性状，如种子在高渗容溶液中的发芽率、受旱幼苗的存活率、叶片的导电率和电阻变化、叶片的水势和渗透势，间接推断作物的抗旱性。（四）抗寒性。抗寒性的鉴定方法也可以分为直接鉴定和间接鉴定。1、 直接鉴定。在田间自然条件下，于低温过后，调查死苗率或死蘖率、受害植株百分率，减产程度等进行评定。它是鉴定的可靠方法。2、 间接鉴定。在直接鉴定比较困难时，我们可以测定一些生化指标：RNA、可溶性蛋白、磷脂、抗坏血酸等含量的变化；酶的活性、电导率、PH值等来间接评价作物的抗寒性。品系鉴定、品比试验及区域试验：一、 品系鉴定与品比试验。共同点：通过小区试验，鉴定品系的遗传稳定性，丰产性，以及育种目标要求的其它性状。区别：品系鉴定的供试材料数量较多，一般不设置重复：品系比较供试材料是通过品系鉴定后选择的优良材料，数量较少，采用随机区组设计，重复3次，并对所需性状进行严格的鉴定，筛选最好的材料进入区域试验。二、 区域试验。区域试验是由有关部门组织的、在一定的自然区域内的多点、多年的品种比较试验，分为全国和省（市、自治区）两级。品种审定：品种选育是新品种选育的最后一项程序，是具有法律作用的程序。种子经审定合格后，方可正式命名并进行大面积推广应用。申请品种审定所需提交的材料：1、选育报告。2、区域试验结果。3、生产试验及栽培试验结果。4、品种标准、抗性及品质测试结果。5、实物标本及照片。转化后代的性状变异包括：形态特征的变异、生长发育性状的变异、生理生化特征的变异、抗性的变异、品质性状的变异、育性的变异等。（原因）1、改变了受体遗传基础；2、基因调控表达的改变；3、基因相互作用的改变；4、其它原因（特点）1、变异的随机性；2、变异的广泛性；3、通常带有供体的某些性状；4、变异的意外性；以水稻为例说明转化后代的性状变异：一、 形态特征的变异：形态特征是指植株根、茎、叶、花、种子、果实的色泽、性状和大小；植株高矮、茎叶着生姿态；生长习性直立、匍匐；茎蘖着生的集散程度；茸毛的多少、硬软，芒的有无、长短等，二、 生长发育性状的变异：外源DNA导入水稻的后代，生育期的变异一般不超出供体与受体的生育期范围，多数倾向于受体，即与受体生育期大致接近。当以早熟品种为受体时，出现超早熟类型的变异较少，而出现稍迟的类型较多；当以迟熟品种为受体时，则出现比受体早熟的类型的几率比较大。三、 生理生化特征的变异：以密穗高粱DNA用花粉管通道法导入受体晚粳稻品种鄂宜105，导入后代于大田测定剑叶净光合速率。密穗高粱为C4作物，净光合速率比受体水稻高2倍多，导入后代有明显提高，有的株系比受体提高84.76%。四、 抗性的变异：采用幼穗期茎注射法导入外源DNA，经多次鉴定筛选获得7个稻瘟病抗性株系，稻瘟病抗性变异率为2.27%。五、 品质性状的变异：对外源DNA导入后代的稻米品质变异进行了比较完整的研究，研究表明稻米垩白度变异最显著，变异系数达到37.78%。六、 育性变异：外源DNA导入后代，在水稻、小麦等作物上均发现了育性变异，即出现不育株。不育现象产生的原因可能与外源DNA在整合、重组过程导致生理功能紊乱所致。植物遗传研究中常用的分子标记：RFLP—RestrictionFragmentLengthPolymorphismRAPD—RandomAmplifiedPolymorphicDNAs（DAF,AP-PCR）SSR—SimpleSequenceRepeatAFLP—AmplifiedFragmentLengthPolymorphism针对非确定DNA的分子检测的方法：一、RFLP法：限制性片段长度多态性，即DNA分子经限制性内切酶水解后的片段在一个物种的不同个体间表现出多态性。植物的基因组DNA经限制性内切酶切割和以某分子探针进行Southern杂交后也表现出多态性，这种多态性可由点突变使限制酶位点增减，或其附近位点DNA的缺失、插入等结构突变而产生。RFLP以孟德尔方式遗传，可以作为一种遗传标记。（原理）检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。（步骤）酶切一电泳一印迹一杂交一洗脱一放射自显影（RFLP探针）来源：cDNA探针（保守性较强，探针检测的多态性频率较低）与基因组DNA（gDNA）探针（检测的多态性频率较高，但不同种属特异性较强）（特点）优点：共显性，可以区别纯合和杂合基因型；稳定、重复性强；某些植物中开发探针已遍及整个基因组。缺点：DNA需要量较大，技术复杂；用于做图较费时，难以分析大量样品；在基因组较大、严格自花授粉作物上多态性很低，使遗传图饱和度低。二、 RAPD检测法RAPD即随机扩增多态性DNA（randomlyamplifiedpolymorphicDNA）,是以PCR扩增为基础的一种研究遗传物质DNA差异性的新技术。（原理）RAPD是建立在PCR技术之上的一种分子标记方法，它是以一系列不同的随机排列的寡聚核酸单链为引物，对于所研究的基因组DNA进行扩增，扩增产物通过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性，RAPD所使用的引物各不相同，对于任一特定的引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些特定的结合位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反应的条件，随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3‘-端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，如果基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就能够导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物增加或者减少，发生分子量的变化，通过对于PCR产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。（主要步骤）提取DNA；用随机引物（10bp）进行PCR扩增；扩增产物电泳分离（3v/cm,6hr）;EB（漠化乙锭）染色（15min）;紫外线下观察、拍照；RAPD带的分析。（特点）（1）不需DNA探针，设计引物也不需要知道序列信息；（2）用一个引物就可扩增出许多片段（一般一个引物可扩增6-12条片段，但对某些材料可能不能产生扩增产物），总的来说RAPD在检测多态性时是一种相当快速的方法；（3）技术简单，RAPD分析不涉及Southern杂交、放射自显影或其它技术；⑷不象RFLP分析，RAPD分析只需少量DNA样品；（5）成本较低，因为随机引物可在公司买到，其价格不高；（6）RAPD标记一般是显性遗传（极少数是共显性遗传的），这样对扩增产物的记录就可记为'有/无”，但这也意味着不能鉴别杂合子和纯合子；（8）RAPD分析中存在的最大问题是重复性不太高，因为在PCR反应中条件的变化会引起一些扩增产物的改变；但是，如果把条件标准化，还是可以获得重复结果的;（9）由于存在共迁移问题，在不同个体中出现相同分子量的带后，并不能保证这些个体拥有同一条（同源）的片段；同时，在胶上看见的一条带也有可能包含了不同的扩增产物，因为所用的凝胶电泳类型（一般是琼脂糖凝胶电泳）只能分开不同大小的片段，而不能分开有不同碱基序列但有相同大小的片段。（缺点）RAPD图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析；用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离。三、 AFLP检测：扩增片段长度多态性，是一种DNA分子标记技术。利用这一方法，在不需要预先知道DNA序列信息的情况下就可以同时进行多数DNA酶切片的PCR扩增。（原理）植物基因组DNA经限制性内切酶双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，将特定双链接头（adapter）连接在这些DNA片段的两端，形成一个带接头的特异片段，作为DNA扩增的模板。接头序列以及与其相连的限制位点作为随后进行的限制片段扩增的引物结合位点。PCR引物3’末端含有选择核苷酸，选择核苷酸延伸到酶切片段区，这样就只有那些两端序列能与选择核苷酸配对的限制性酶切片段被扩增。扩增片段通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。（特点）优点：（1）由于内切酶及选择性碱基组合数和种类很多，产生标记数无限，可覆盖整个基因组。（2）多态性远远超过其它分子标记，一般可检测到50-100个AFLP扩增产物，能够在遗传关系十分相近的材料产生多态性，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。（3）AFLP分析由于扩增片段较短（30-700bp），分辨率高。缺点：试剂盒价格昂贵；另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格。（操作步骤）1.酶切--连接；2.PCR扩增，使目的序列扩增到0.5〜却g；3.电泳分离（利用聚丙烯酰胺凝胶）。对于基因组较大的物种，需要进行两步扩增一预扩增和选择性扩增。为什么用双酶解?适合PCR扩增效率与变性胶的分辨率；减少PCR扩增的片段，从而减少使用选择性碱基的数目；使标记单链成为可能；增加PCR扩增的灵活性；增加使用引物的灵活性。为什么要预扩增?减少选择性碱基的错配；减轻背景；提供足量模板DNA；降低模板浓度的影响。四、 SSR分子标记（原理）利用某一SSR两翼区域特定的DNA序列，来设计位点专一的引物，在PCR仪上扩增单个SSR位点，通过电泳，进行分析，在此基础上进行相应的遗传分析。（SSR的分布特点）不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR（1-4bp）的搜索,发现：（AT）最丰富,然后依次是：（A）、（T）、（AG）、（CT）、（AAT）、（ATT）、（AAC）、（GTT）、（AGC）、A n nn n n n n n n n（GCT）、（AAG）、（CTT）、（AATT）、（TTAA）、（AAAT）、（ATTT）及（AC）、（GT）。同一类内碱基种类不同的SSR,n n n n n n n n n丰度差别很大。（SSR的功能）编码氨基酸；染色体末端的SSR，保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能；提高或降低临近基因转录速率；基因重组的热点，是基因变异的来源；部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体。（SSR分析）两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长度多态性。不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。（SSR的特点）优点：两侧顺序保守，在同种间多相同；数量丰富，在整个基因组均匀随机分布；实验重复性好，结果可靠；多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异；共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子；仅需微量组织，适合PCR分析半自动化。缺点：相对的物种专一性；由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序列设计引物，需建立基因文库、克隆识别与筛选、测序等过程，开发困难，费用较高，耗时长；实际分析时一般每次只分析单个位点；不同引物退火温度不同，需要探索。（SSR的检测）琼脂糖凝胶检测（同前）；聚丙烯酰胺凝胶检测；一般采用银染、荧光检测。五、同工酶标记凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶（isoenzyme）。（原理）聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。凝胶电泳兼有电荷效应和分子筛效应。被分离物质由于所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的泳动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可在凝胶中展现出酶谱。过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。（实验步骤）安装电泳槽。凝胶的配制。过氧化物酶的提取。称取1g待测植物鲜样置于冰浴上的研钵内，加入1mlH2O或0.05mol/LTris-HCl缓冲液（pH6.8）研成匀浆，转入离心管，再用2ml前述溶液将附着在研钵壁上的研磨样品洗下并全部转入离心管，3500rpm离心15〜20min，其上清液即为酶的提取液，供电泳分析用。点样：用微量注射器吸取上清液，每管加样50pl，再分别加入40%蔗糖溶液5pl，之后再用注射器将电极缓冲液慢慢加入每支胶管至浸没顶部为止.最后向上、下电泳槽倒入电极缓冲液（上槽必须淹没管顶，下槽液要能浸泡着凝胶管），最后在上槽液中滴入1〜2滴漠酚蓝溶液。电泳：将电泳槽放至低温处，最好在4°C左右，或接通电泳槽水冷却系统按上“一”下“+”接好导线，通电，电泳开始电流应低，每管1mA，10min后，再加大电流，使每管达到2〜3mA，当漠酚蓝指示剂达到距管底约1cm处时，切断电流，停止电泳。剥胶：电泳完毕，将电泳槽取出，倒去缓冲液，取下凝胶管，放入培养皿中。用一个带有长针头的注射器，吸满水，将针头沿管壁插入，同时慢慢地将注射器中的水推出，并不断转动凝胶管，将凝胶管挤脱出来，也可用洗耳球挤压。染色：取0.5ml联苯胺母液+H2O9.3ml+0.2ml3%H2O2，混匀后倒入盛有凝胶条的培养皿。此时可以看到胶条上出现蓝色或棕褐色环，即过氧化物酶带，约10min后用自来水冲洗，这时蓝色带也慢慢变成棕褐色。记录酶谱，并计算各同工酶的迁移率。转基因作物的生物安全是指人们在从事转基因作物的研究过程中，从研究、开发、生产到实际应用整个过程中的安全性问题。也就是要对转基因技术本身及其产品可能对人类和环境的不利影响及其不确定性和风险性进行科学评估，并采取必要的措施加以管理和控制使之降低到可以接受的程度，以保障人类的健康和环境的安全。生物技术也可能给自然环境和人类健康带来潜在威胁：1外源基因对受体作物的影响。外源基因对受体植物的影响包括标记基因对作物的影响、外源基因的插入对作物的影响、外源基因对作物的影响。2对非靶生物的影响。转基因植物对非靶生物的影响，主要包括对近缘生物的影响、对土壤微生物区系的影响、抗虫基因植物对有益和其它昆虫的影响、抗病毒转基因植物中发生病毒异源包装的活重组的可能性、转基因植株残渣对下季作物的影响。3防止基因漂流。基因漂流可以定义为将一个群体的基因库转移到另一个群体的基因库。这种基因转移是自然群体中遗传结构的主要决定因素。它也指不同物种或生物群体之间遗传物质的转移，包括花粉飘移和无性繁殖体的混杂。4食品安全性。转基因生物产品的食品安全性包括目的基因、标记基因和报告基因对人类的安全性。目的基因安全性的评估有：天然有毒物质、营养成分及抗营养因子、过敏原、农艺性状、所转基因的稳定性及插入突变、基因的多效性及次级效应。转基因作物品种的审定推广程序安全评价：五个阶段：试验研究一中间试验一环境释放一生产性试验一申请安全证书生产、经营管理：与相关法规衔接：接照有关规定进行审定、登记、审批，取得生产许可证、经营许可证及相关批件。植物育种学的内容：1.种质资源的搜集、研究和利用。2.育种目标3.育种方法4.育种程序育种实践证明，育种上要有新突破，目前必须抓住两项工作：1、广泛收集有益的种质资源，并加以利用；2、育种方法上进一步革新。PCR聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）,是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行酶促合成特异DNA片段的一种方法。具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点（原理）原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93^左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55^左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链.重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2〜4分钟，2〜3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+（设计引物应遵循以下原则）：①引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌吟或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1〜1pM或10〜100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从嗜热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量1-2.5U（指总反应体积为100gl时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1MNaOH或1MTris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0〜7.5，小量分装，-20°C冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50〜200gmol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200gmol/L时，Mg2+浓度为1.5〜2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90〜95C变性，再迅速冷却至40〜60C，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70〜75C，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100〜300bp时）可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94C变性，65C左右退火与延伸（此温度TaqDNA酶仍有较高的催化活性）。变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，93C〜94Clmin足以使模板DNA变性，若低于93C则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40C〜60C，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55C为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4（G+C）+2（A+T） 复性温度=Tm值-（5〜10C）在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30〜60sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在70〜75C之间，常用温度为72C，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3〜4kb的靶序列需3〜4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数：循环次数决定PCR扩增程度°PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30〜40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。分子杂交：利用标记的分子探针与变性并固着在支持物（如尼龙膜、硝酸纤维素膜等）上的分子经复性互补形成杂交分子，来检测与探针同源互补分子存在的一种分子检测方法，常用的如Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、点杂交等。（基本原理）具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链。这一过程称为核酸分子杂交。（探针的种类）根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针等几类。基因组DNA探针：来源方便。但是，探针中可能因高度重复序列存在引起非特异性杂交而出现假阳性结果。cDNA探针：cDNA探针不易获得，从而限制了它的广泛使用。另外，其中的poly（dA）产生的非特异性杂交问题。RNA探针1）RNA/RNA和RNA/DNA杂交体的稳定性较DNA/DNA高，因此杂交反应可以在更为严格的条件下进行（提高10摄氏度），杂交的特异性更高；2）单链RNA分子由于不存在互补双链的竞争性结合，其与待测核酸顺序杂交的效率较高；3）RNA中不存在高度重复序列，因此非特异性杂交也较少；4）杂交后可用RNase将未杂交的探针分子消化掉，从而使本底降低。人工合成的寡核苷酸探针：探针长度只有15〜50bp，特别适合于基因点突变的分析；由于序列的复杂性降低，杂交所需时间也较短。理想的探针标记物，应具备以下几种优点：1）高度灵敏性；2）标记物与核酸探针的结合应绝对不能影响其碱基配对的特异性；3）应不影响探针分子的主要的理化特性，特别是杂交特异性和杂交稳定性；4）当用酶促方法进行标记时，应对酶促活性无较大影响，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性；5）检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性，尽量减低假阳性率。6）应具有较高的化学稳定性，保存时间较长，标记及检测方法简单；对环境无污染，对人体无损害；价格低廉等。转基因油菜的southern杂交：1样品DNA凝胶电泳将各转基因油菜的第二代与第三代的PCR产物，酶切回收后的DNA，非转基因油菜对照等DNA进行1%的琼脂糖凝胶电泳，检测高质量、无污染的目标DNA实验杂交的关键。电泳后把凝胶放在凝胶分析系统上拍照。2DNA的碱性转移1） 准备1L的5XSSC10mMNaOH碱性转移液。按照供应商推荐的方法处理尼龙膜。对于一块12cmX14cm的凝胶来清洗1L的转移缓冲液足够了，最好是阳性膜，一般用干净的镊子取膜。2） 如果需要在两倍于凝胶体积的0.25NHCl中促DNA脱嘌吟。（10分钟，室温，轻轻搅动）。3） 在超纯水中的凝胶置于2倍于凝胶的0.5NNaOH/1.5MNaCl溶液中共培养30分钟。4） 在室温下用2倍于凝胶体积的碱性转移缓冲液中清洗2次，每次10分钟，使凝胶平衡。5） 用转移缓冲液做溶剂，做一个毛细管转移装置。置于转移装置的顶部的重量不要超过2-3g/cm2的凝胶。6） 转移时间根据在凝胶的DNA的数量而定>5pg转3h<5pg转2h<100ng转1h转移后，用5XSSC漂洗膜5分钟，将膜置于滤纸上2-4分钟，用紫外光交联仪或真空烤箱把DNA固定在膜上。7） 用两张印迹纸夹住膜以保存，封在杂交袋中保存在阴凉干燥的地方。3预杂交/杂交1） 把装有甲酰胺杂交缓冲液的瓶子置于水中，或在37摄氏度溶解沉淀的SDS。2） 根据实验的需要加入预杂交缓冲液，0.06ml/cm2。3） 用剪切并变性的鲱鱼或鲑鱼精DNA制备预杂交液，甲酰胺的最终浓度为200pg/ml，使用KPL的鲑鱼精DNA，加10pl/ml杂交缓冲液。4） 把膜放入杂交瓶使DNA朝向瓶中间或者放入杂交袋，加入预杂交液。（如果把膜密封在热密封的塑料杂交袋中杂交，尽可能在密封前赶走空气和气泡，为取得理想的结果，密封袋子的时候要靠近膜，不要让膜粘在一起或粘在杂交袋的边上，以免取出膜时很困难。）5） 在42摄氏度培养1h，并连续搅动。6） 在95摄氏度处理10分钟使DNA探针变性取出后迅速放到冰上，不要用碱性液使探针变性7） 在杂交液中加入探针，50ng/ml，把探针直接加到缓冲液中并搅动。8） 在42摄氏度培养3-16小时搅动。9） 准备杂交后漂洗液，0.5XSSPE，取小部分于室温，其余放到50摄氏度漂洗液，调整SSPE或SDS的浓度，用于严格的杂交，在使用之前在50摄氏度平衡2h。10） 在杂交液中取出膜用0.5XSSPE漂洗2X10分钟，（至少1mL/cm2）。（含有探针的杂交液可以回收利用，可置于无菌管中于2-8摄氏度保存，在使用之前于68摄氏度下10分钟变性，但不能煮沸。）11） 在50摄氏度的均衡液中轻轻漂洗2X10分钟，使清洗液覆盖在膜上。（在杂交和检测中不要让膜干燥）4Southern杂交检测1） 准备足够的1X封闭液用于封闭，每cm2膜至少使用0.3ml/l封闭液。2） 在杂交点的盘用1X的封闭液30分钟共培，所有步骤在室温下进行，并轻轻搅动，当封闭液不能自由流动时，减小容器体积或增大容器体积。3） 用新制的1X封闭液稀释HRP-SA到500倍，充分混合。4） 在第二步，倒掉膜上的封闭液，1X封闭液稀释HRP-SA液，共培20分钟。5） 转移膜到一个干净的容器，在1X封闭液稀释HPL-SA液的生物素漂洗液中漂洗3次，每次5分钟，0.4ml/cm2。5） 转移膜到一个干净的容器，在1X封闭液稀释HRP-SA液的生物素漂洗液中漂洗3次，每次5分钟，0.4ml/cm2。6） 用等体积的A和B混合液制备LumiGLO化学发光底物使膜完全浸泡，在4摄氏度制备好的GLO可以稳定24h。7）