第二章 蛋白质与酶学基础3

第二章蛋白质与酶学基础2.1、概论2.2、酶的作用机理2.3、酶的结构与功能2.4、酶促反应动力学2.5、酶的活性调控2.6、酶的稳定性酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响酶促反应速度的各种因素，包括底物浓度、酶浓度、pH、温度、激活剂与抑制剂等。2.4、酶促反应动力学酶促反应动力学基本公式

催化反应进行中的[ES]量恒定，也就是說[ES]的生成量等于其消失量；[ES]的生成量等于k1[E][S][ES]的消失量则有兩个方向：等于生成量，则可以得到上图其一当然是变成了[E]+[P]，受到k3的控制；因此其消失量为k3[ES]；另一个消失方式为退回去成为[E]+[S]，即为k2[ES]。

因此，得到（I）式酶促反应动力学基本公式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式另外，我们定义总酶量[Et]等于自由的酶[Ef]加上已经与基质结合的酶[ES]，因此可以得到(II)式酶促反应动力学基本公式催化反应整体表現出來的速率vo決定于后半段的反应，也就是说只要看生成物的产量[ES]→[E]+[P]；因此vo可以說是k3[ES]，得到(III)式。酶促反应动力学基本公式所有的酶[Et]都变成[ES]时，将会达到想象中的最高速率Vmax，则可写成(IV)式Vmax=k3[Et]。所有的酶[Et]都变成[ES]时，将会达到想象中的最高速率Vmax，则可写成(IV)式Vmax=k3[Et]。所有的酶[Et]都变成[ES]时，将会达到想象中的最高速率Vmax，则可写成(IV)式酶促反应动力学基本公式vo=Vmax[S]Km

+

[S]KmVmax&E1E2E31storderzeroorder直接做图双倒数做图与底物的亲和力催化的最大速率活性单位改变底物浓度[S]观察vo的改变可以作图法求得Vmax

和Kmk3[Et]kcatCatalyticnumberkcat

/

KmActivityUnit1mmolemin比活性unitmgSignificance催化常数,kcatvo

=Vmax

[S]Km

+

[S](vo)E+SES

E+Pk2k1k3Whensubstrateexcess,

k3

=

kcat,catalyticnumberWhen[substrate]islow=k3[E][S]Km

+

[S]=Kmk3[E][S]Omitthe[substrate]SubstratespecificityStartfromM-Meq.Secondorder(IV)一些酶的催化常数过氧化氢酶

H2O2碳酸酐酶

HCO3-乙酰胆碱酯酶

Acetylcholine40,000,000400,000140,000b-内酰胺酶

Benzylpenicillin2,000延胡索酸酶

Fumarate800

ATP酶

ATP0.4酶底物kcat

(s-1)每一分子酶每秒钟所能转换底物分子的数目

O

R

OH3C–C–N–C–C–O–CH3

H

H=–=––胰凝乳蛋白酶对不同底物的kcat

/

Km–HGlycinekcat/Km1.3╳10-1–CH2–CH2–CH3Norvaline3.6╳102–CH2–CH2–CH2–CH3Norleucine3.0╳103–CH2–Phenylalanine1.0╳105(M-1·s-1)R=用kcat/Km可以同时同时监视酶对基质的亲和力，以及该酶的Vmax(kcat)，是一个比较理想的酶行为指标；此一比值越大者，有越好的催化力。

影响酶反应速率的主要因素分类影响速率的主要因素从其研究可获得的信息浓度因素酶浓度、底物浓度、产物浓度、效应物浓度反应机理、反应速率常数(速率参数)外部因素(反应环境)温度标准热力学量及活化热力学量;速率参数的物理意义等pH对反应有贡献的活性解离pK值及解离热(温度对pK值的效果);解离基团的种类及其作用离子强度盐类浓度的影响溶剂介电常数随着反应产生的静电变化(电荷分布状态的变化)内部因素(结构因素)底物或效应物的结构底物、效应物和酶相结合的性质;酶活性部位的结构等酶的结构酶的催化活性以及同底物结合，必要的氨基酸残基；活性必需的立体结构等vo=Vmax[S]Km

+

[S]KmVmax&E1E2E31storderzeroorderCompetitiveNon-competitiveUncompetitive直接做图双倒数做图双底物反应也可应用在M-M公式，但在测定时另一个底物的浓度要饱和与底物的亲和力催化的最大速率酶抑制活性单位改变底物浓度[S]观察vo的改变可以作图法求得Vmax

和Kmk3[Et]kcatCatalyticnumberkcat

/

KmActivityUnit1mmolemin比活性unitmgSignificance酶的抑制可逆性抑制不可逆抑制抑制剂与酶非共价结合抑制剂与酶共价性修饰竞争性非竞争性反竞争性Penicillin青霉素重金属(Hg,Pb)DFP,TPCKSarin(-Ser)PCMB(-Cys)竞争性非竞争性反竞争性EEDifferentsiteCompeteforactivesiteInhibitorSubstrate[I]bindstofree[E]only,andcompeteswith[S];increasing[S]overcomesInhibitionby[I].[I]bindstofree[E]or[ES]complex;Increasing[S]cannotovercome[I]inhibition.[I]bindsto[ES]complexonly,increasing[S]favorstheinhibitionby[I].E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EI

←

↑E+S

→

ES

→

E+P++

I

I↓↓EI

+

S

→EIS

←

↑

↑E+S

→

ES

→

E+P+

I↓EIS

←

↑X图解抑制基理及说明酶的抑制(机制)酶的抑制(做图)竞争性非竞争性反竞争性Vmax

和

Km

都变小Km[S],mMVmaxIKm’Vmax’ITwoparallellines1/[S]1/Km1/

Vmax1/voKmVmax[S],mMvoIVmax’Vmax

变小Km

不变IIntersectatXaxis1/vo1/

Vmax1/[S]1/Km=

Km’VmaxKmKm’[S],mMvoIVmax

不变Km

变大I1/[S]1/Km1/vo1/

VmaxIntersectatYaxis双倒数做图直接做图竞争性抑制SuccinateGlutarateMalonateOxalate琥珀酸脱氢酶底物竞争性抑制剂产物C-OO-

C-H

C-H

C-OO-

C-OO-

H-C-H

H-C-H

C-OO-

C-OO-

H-C-H

H-C-H

H-C-H

C-OO-C-OO-

C-OO-

C-OO-

H-C-H

C-OO-为何是抑制剂而非底物？磺胺类药也是一种竞争性抑制剂-COOHH2N--SONH2H2N-前体叶酸四氢化叶酸Sulfanilamide磺胺类药(消炎药)对氨基苯甲酸(PABA)细菌的叶酸合成需要PABA磺胺类可分别抑制二氢叶酸合成酶与二氢叶酸还原酶,妨碍叶酸代谢,最终影响核酸合成,从而抑制细菌的生长和繁殖。抑制剂Inhibitor胰蛋白酶Trypsin不可逆的蛋白酶抑制剂HIV蛋白酶与天冬氨酸蛋白酶

不对称单体↓

HIV蛋白酶

(同源二聚体)

HIV蛋白酶

抑制剂可抑制HIV增殖对称二聚体Aspsubunit2↑天冬氨酸蛋白酶(单体)subunit1Aspdomain1domain2AspAsp天冬氨酸蛋白酶以天冬氨酸吸住水分子此水分子将参与水解反应设计专一性的抑制剂HIV病毒存活需要Asp蛋白酶人类也有类似的Asp蛋白酶病毒蛋白酶活性会受抑制剂干扰设計抑制剂药物只会攻击病毒人体不會受害分子对称的HIVProtease抑制剂Drugdesign药物设计CombinatoryChemistry组合化学HIV蛋白酶青霉素Penicillin抗生素●细菌细胞壁合成：酶GT

把短链多肽▲接到细胞壁●不可逆性抑制攻击活性区！共价性修饰细菌细胞壁含有短链氨基酸SugarchainGlycopeptideTranspeptidase(GT)把短链多肽接到多糖五肽骨架tetrapeptidepentaglycine青霉素Penicillin抗生素●细菌细胞壁合成：酶GT

把短链多肽▲接到细胞壁●→青霉素类似酶GT

底物D-Ala-D-Ala(木马屠城)→青霉素与酶GT

活性区Ser-OH

反应(捕鼠器)●化学修饰剂：→共价修饰活性区上的氨基酸，抑制酶活性。[E]-Cys-SH...PCMB←人造的proteaseinhibitor↓[E]-Ser-OH...DFP,TPCK(抑制胰凝乳蛋白酶);TLCK(胰蛋白酶)→

Sarin神经毒气(抑制乙酰胆碱酯酶)不可逆性抑制攻击活性区！共价性修饰Penicillin与酶GT活性区结合Penicillin构形类似细菌多糖四元环糖肽骨架化学性共价修饰剂有些毒气是酶抑制剂RegulatorysubunitPRR+orinhibitorproteolysisphosphorylationcAMPorcalmodulinorregulatoreffectorP(-)(+)InhibitorProteolysisPhosophorylationSignaltransductionFeedbackregulation2.5、酶的活性调控

酶原(zymogen)：酶的无活性的前体

酶原的激活：由无活性的酶原转变为有活性的酶的过程。

酶原激活的意义：在特定的环境和条件下发挥作用；避免细胞自身消化；有的酶原可以视为酶的储存形式。（一）蛋白质裂解：不可逆的共价性修饰

酶原激活的机理:酶原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心

一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下一些蛋白质裂解的例子●

胰岛素Insulin(非酶):Achain&Bchain；Cchain●凝血机制Fibrin←Thrombin←←←←←伤口以cascade(梯瀑式)诱发极为危险的凝血反应●蛋白酶原活化机制Trypsin,Chymotrypsin,ElastaseCT切出新的N-端(Ile16)可结合Asp194→定位Ser195Zymogen酶原(危险的酶)→以胞器隔离之胰岛素分子含有A、B两条多肽链，链间以2对二硫键相连。A链内还有1对二硫键。611S-SSSSS720197ArgArgArgLysS-SSSSS胰岛素C肽+胰岛素原前胰岛素原是胰岛素原的前体。前胰岛素原与胰岛素原相比，比胰岛素原在N端多了一个肽段。此肽段称为信号肽。凝血机制是一连串蛋白酶的作用

都是蛋白酶纤维蛋白原纤维蛋白怪头博士的绝妙发明

CascadenSnP1Enzyme梯瀑式放大效应一传十十传百蛋白酶之间互相裂解活化胰蛋白酶原胰蛋白酶肠激酶胰凝乳蛋白酶原π胰凝乳蛋白酶α