核酸分子杂交技术-11-04

核酸分子杂交技术严永敏细胞与分子诊断系1目录根本原理核酸探针核酸分子杂交技术2变性在热、酸碱或变性剂作用下，DNA双螺旋的氢键断裂，解离为两条单链DNA的现象称为变性。变性的特征生物学活性丧失,增色效应核酸的变性与复性3磷酸二酯键

DNA和RNA的一级结构4DNA解链曲线增色效应(hyperchromiceffect)

核酸分子加热变性时，其在260nm处的紫外吸收急剧增加的现象。Tm值：当紫外吸收变化到达最大变化的半数值时，此时所对应的温度称为熔解温度〔Tm〕、变性温度或中点解链温度。5分子杂交当两条不同来源的单链核酸分子DNA-RNA或DNA-DNA链之间存在互补的碱基序列时，通过碱基互补配对形成双链杂交体的过程，称为分子杂交〔molecularhybridization〕。分子杂交图89概念：用同位素或其他化学方法标记的与待测靶核苷酸序列互补杂交的核酸片段〔DNA或RNA〕。用途：检测待检核酸样品中的特定基因序列。(DNA-DNA;DNA-RNA;RNA-RNA)要求：特异性，来源方便第二节核酸探针10

hybridizationDNA:DNA5’ATGCCGAT3’TACGGCDNA:RNA5’ATGCGTA3’UACGCAURNA:RNA5’AUGCUACG3’UACGAUGC111)基因组DNA探针；2)cDNA探针；3)RNA探针；核酸探针的类型：4)寡核苷酸探针。12〔一〕基因组DNA探针1.来源：这类探针来源于某种生物的基因组多为某一基因的全部或局部序列。2.制备方法:〔1〕基因克隆的方法〔2〕聚合酶链反响(PCR)

133.特点:〔1〕多克隆在载体中的DNA片段，可以无限繁殖，取之不尽。〔2〕相对RNA而言，DNA探针不易降解，标记方法也较成熟。14〔二〕cDNA探针1.制备:cDNA文库中筛选。2.特点:不存在内含子和高度重复序列，是一种较理想的核酸探针，尤其是用于基因表达的研究。15〔三〕RNA探针特点：1〕单链探针，效率高，灵敏度高；2〕RNA/RNA、RNA/DNA更稳定，特异性高；3〕不稳定，易降解。16〔四〕寡核苷酸探针特点:◆根据需要来合成相应的核酸序列，防止天然探针的缺点；◆大多数长度一般为20～50bp；◆由于探针的长度较短，特异性较低，杂交信号较弱17常用的探针标记物：

放射性同位素：

3H、32P、35S、125I等。核酸探针的标记特点:◆灵敏度高，特异性高；◆检出限：1~10ug；◆环境污染，半衰期短。18常用放射性核素的物理性质αβγ非放射性19FITC异硫氰酸酯TRITC硫氰酸四甲基罗达明人染色体不同荧光素染色结果

非放射性同位素：荧光染料、地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。20缺口平移标记法示意图酶促法1.缺口平移法〔nicktranslation〕探针标记方法:212．随机引物法(randompriming)人工合成6~8bp各种不同排列顺序混合物引物在DNA聚合酶作用下，合成与探针DNA互补的DNA链，当在反响液中参加一种被标记dNTP时，即可形成标记的DNA探针，但探针DNA序列是长短不等的。优点：比活度高，结果稳定22随机引物标记法示意图233．DNA探针的末端标记

〔1〕Klenow大片段的末端标记法323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段

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Klenow片段

604个氨基酸DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶24利用KlenowDNA聚合酶标记3’-端DNA探针

25〔2〕多核苷酸激酶标记法〔polynucleofidekinase，PNK)多核苷酸激酶标记法示意图*不能进行非放射性标记26DNA半抗原标记探针的检测显色系统：碱性磷酸酶——————NBT辣根过氧化物酶————DAB底物非放射性探针的检测四唑硝基蓝二氨基联苯胺27制备特异性探针所需要的根本条件1.被检基因结构清楚；2.有明确的基因产物;3.某一基因产物；

具备以上条件之一就可以制备特异性基因探针。28第三节核酸分子杂交技术杂交类型检测目的及范围Southern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的DNA分子Northern印迹杂交检测经凝胶电泳分离且转移至膜上的RNA分子菌落杂交检测固定在膜上，经裂解从细菌体释放的DNA分子斑点杂交检测固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子29PaperTowels1tissueSDSProtKPhenolChloroETOHSpin一、Southern印迹杂交

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毛细管转移示意图电转移示意图31

Northern印迹杂交流程图二、Northern印迹杂交32Southern杂交结果Northern杂交结果33基因表达产物的检测

Western印迹法蛋白质水平上的杂交技术，又称为免疫印迹，即检测蛋白质与标记的特定蛋白抗体结合，经放射自显影显示条带，根据条带密度确定蛋白质表达量。优点:分辨率高(1~5ng);特异;简便;稳定34准备PAGE胶样品的制备加样SDS(蛋白先定量)蛋白质的电转移