表面增强拉曼光谱对饮料中核黄素的检测食品工程专业

表面增强拉曼光谱对饮料中核黄素的检测1前言1.1核黄素概述1.1.1核黄素简介核黄素通常又被人们称之为维生素B2，其微溶于水溶液，若想使其达到稳定的状态，则应在加热条件下，将其放于中性亦或为微酸性的溶液当中。从本质上而言，其实则为生物体当中黄酶类辅基所含有的关键物质，却缺乏此类物质，则生物体可能会出现代谢障碍[9]。由此而引发的病变，一般为眼部以及生殖器等生物体器官的炎症，例如：唇炎以及眼结膜炎等。故而一旦出现上述病症，则将能借助于核黄素的作用诊治。1.1.2核黄素生理功能生物体内部将会频繁出现能量代谢以及相应的生物氧化现象，此类现象通常和碳水化合物以及核酸等物质的新陈代谢息息相关，并能有效增强蛋白质的实际利用率，从而有效推进生物体的生长发育。除此之外，核黄素还能有助于保护皮脂腺等人体组织。营养素应当参与人体细胞所涉及的生长代谢过程，例如：肾上腺素可有助于人体的分泌调节等。B族维生素将可有助于促进烟酸等物质的新陈代谢[10]。FAD以及FMN将会被当做为辅基，使得色氨酸得以成功转换为尼克酸，与此同时，还可促进维生素B6成功转换为磷酸吡哆醛。不仅如此，胡黄素还表现出良好的抗氧化活性，这或许得益于黄素酶-谷胱甘肽还原酶的关键作用。1.2传统核黄素检测方法1.2.1微生物法干酪乳酸杆菌若想获得稳定生长，则必须依赖于充足的维生素B2，当处于某种情况下，培养基当中所含的维生素B2含量，将会和LC的实际生长状态息息相关，并且和该物质所产生的代谢物乳酸浓度，呈现出正比例的内在关系。故而若想针对某特定样品中，所含有的维生素B2含量，进行相对深入的细致测定，则将可借助于LC代谢物的浑浊度进行精准判定。1.2.2荧光法维生素B2实则微溶于水，并表现出黄绿色荧光。当处于稀释液环境下，若核黄素的浓度越高，则其所表现出的荧光强度也将更为显著。基于上述特性，荧光分光光度法应运而生，此类方法无需运用过于复杂的机器，即可使得测量过程表现出相对较高的反应速度，故而其在维生素B2的分析领域当中，逐步获得相对广泛的实际应用[11]。然而，此类方法必须处于避光的条件下进行，并且容易受到来源于外部因素的种种局限。1.2.3分光光度法分光光度法实则为中国药典当中所阐述的标准方法，其在当前的维生素B2检测环节，已经获得相对广泛的实际应用。对于此类方法而言，其所需的仪器均较为常规，表现出良好的实用性。然而，其在测定维生素B2含量的过程中，往往会受到来源于外部因素的实际干扰。例如：其在测定中所需的紫外分光光度计，必须保持长期测量，而且测量过程相对复杂，不利于保障后期测定结果的精确性。更加无法达到理想的重现性[12]。基于这一现象，全球学者纷纷对其进行完善，例如：持续优化现有的操作方法，使得样品得以加速溶解等。1.3表面增强拉曼光谱1.3.1SERS简述1928年，全球知名学者拉曼，曾经发现和入射光不一致的散射现象，该学者提出，引发这类现象产生的根本因素，应该是由于散射物质结构的差异性。1930年，该学者因此而获得诺贝尔物理奖[5]。一旦激发光当中的光子，和散射中心当中存在的分子，进行彼此作用的情况下，绝大多数光子将会偏离既定方向产生散射，但却并未改变现有频率。此种类型的弹性散射光，即所谓的瑞利散射。值得一提的是，因为非弹性碰撞而出现的拉曼散射，不仅会使得光子偏离既定的传播方向，而且会改变光子当前的频率，此类散射将会占据总散射光10-10～10-6的比例[5]。1.3.2SERS技术的优点首先，SERS技术将能表现出尤其显著的增强效果，故而其在未来一段时期，将可基于超痕量检测过程，进行精准定量。其次，SERS光谱的本质为某特定的振动光谱，其将可提供分子所涉及的振动信息。在这之中，某些信息将能看作为相应探测物质的指纹，借助于此类指纹，将能有效辨别各种类型的未知物，从而实现定性检测[1]。此外，SERS技术还能基于现场环境进行跟踪检测，这是由于，当应用该项技术来制备样品时简洁易行，无需对样本自身形成损坏。此外其所应用的仪器通常为便携式仪器，故而可实现跟踪检测。最后，SERS技术将能进行直接检测以及相应的间接检测。以前者为例，其一般适用于待测物附着于基底表面的情况，此类方法将能精准检测药物等，例如：三聚氰胺等[2]。1.3.3SERS基底对于各种类型的纳米材料而言，其所含有的实际性质，往往和材料尺寸以及成分息息相关。对于SERS基底而言，由于其旨在借助于纳米材料所含的性质来实现，故而其也将会受到来源于材料的实际影响[13]。一般情况下，SERS光谱所表现出的强度，不仅会和激发光波长息息相关，而且还会和基底纳米材料所涉及的基本结构紧密关联[6]。现如今，全球学者对于SERS技术的研究倾向，通常涉及到下述方面：首先，现今唯有以银和金为例的若干金属，才含有相对良好的增强能力，故而全球学者纷纷致力于找到种类更多的金属，来使得SERS技术的覆盖范围更为广泛。其次，若想制备出略显粗糙的SERS基底，必须打破现有的技术壁垒，将理论和实践有机结合，针对多样化微观结构参数，相对于SERS技术所产生的实际影响，进行更深层次的细致研究[14]。然而由于此类基地不具备良好的稳定性，故而难以在制备时，表现出显著的重现性。最后，SERS技术的机理现今科学界尚未达成共识，有待于进一步探讨。1.4研究意义功能饮料旨在基于水溶液中，添加合理比例的营养素，来达到调节人体功能的效果。从宏观角度来看，功能饮料通常涵盖运动饮料以及相应的保健饮料等[16]。2000年，功能饮料在以欧美为例的西方发达国家当中，备受消费者的广泛青睐。这是由于，其中富含钾以及钙等各类电解质，成分和人体相匹配，一旦人体通过运用而流失这些电解质，仅需服用此类功能饮料，将能即刻被补充，使得人体体液重新回归平衡。正因如此，功能饮料才逐步获得诸多消费者的广泛青睐。然而，大部分国产功能饮料在产品成分上往往只标注大致的范围，不仅很难让人确定饮料各种成分的具体含量，也很难判断饮用后是否会对身体起作用[3]。本文用了表面增强拉曼光谱对核黄素进行检测，该方法将能快速精准的针对功能饮料中所含的核黄素，进行相对深入的细致检测。

2实验材料与方法2.1主要仪器与装置Insprector300便携式拉曼光谱仪（美国赛普斯有限公司）；荧光分光光度计FL-4500（日本日立有限公司）；实验室超纯水机（湖南科尔顿水务有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；IKA加热磁力搅拌器（RCT，德国）；IKA旋涡混匀器（RCT，德国）；石英进样瓶（北京成腾器材有限公司）；98-1-B型电子调温电热套（天津市泰斯特一起有限公司）；各种量程的移液枪；超声波清洗器；ME型号电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。2.2实验试剂核黄素标准品（纯度97.5%~102.0%，上海蓝季科技发展有限公司）；氯金酸（阿拉丁）；柠檬酸钠（分析纯，上海展云化工有限公司）；氯化钠（分析纯，上海展云化工有限公司）；硝酸银（分析纯，上海展云化工有限公司）；功能性饮料（武夷学院超市）。2.3实验样品制备2.3.1纳米金胶的制备溶液1：称取0.01g氯金酸，添加99.99mL去离子水，配制0.01%氯金酸。用棕色瓶，外部用锡箔纸包裹住，放冰箱保鲜。溶液2：称取1g柠檬酸钠，添加99mL去离子水，配制1%柠檬酸钠。合成金胶：将100mL的溶液1放入圆底烧瓶中，在电热套加热，等到沸腾的时候再加入1mL的溶液2。差不多25s后圆底烧瓶里面的溶液会变成微蓝，等到大约70s左右的时候溶液由蓝色变成鲜红，接着让溶液在电热套里面加热持续沸腾25min左右。纳米金胶制作成功之后，待溶液冷却后放入棕色瓶内保存，放冰箱里面保鲜。2.3.2纳米银胶的制备合成银胶：精确称取18.55mg硝酸银，将100mL的去离子水倒入圆底烧瓶，接着加入称量好的硝酸银，通过电热套进行加热，并且充分搅拌，直至溶液达到98℃，滴入柠檬酸钠2mL，使其保持现有状态静置40min，后冷却至室温，即可获得呈现为灰绿色的某特定银胶溶液。2.3.3标准品的制备1mg/mL标准品溶液的配制：精确称取7mg的核黄素的标准品倒入7mL的去离子水中，用超声溶解。其次，依次通过去离子水，将1mg/mL稀释为浓度0.05、0.1、0.5、1.0、10.0、15.0mg/L的标准品。2.3.4样品的制备20倍稀释样品：用移液枪吸取5.0mL功能性饮料，用去离子水定容至100mL。样品溶液加标样本的配制：用移液枪吸取0.2mL的100mg/L的标准品溶液，再吸取1.8mL的样品得到10mg/L的加标溶液。用移液枪吸取0.1mL的100mg/L的标准品溶液，再吸取1.9mL的样品得到5mg/L的加标溶液。用移液枪吸取0.1mL的10mg/L的标准品溶液，再吸取1.9mL的样品得到1mg/L的加标溶液。用移液枪吸取0.5mL的1mg/L的标准品溶液，再吸取0.5mL的样品得到0.5mg/L的加标溶液。用移液枪吸取0.1mL的1mg/L的标准品溶液，再吸取0.9mL的样品得到0.1mg/L的加标溶液。0.1%NaCl标准溶液：称取0.585g氯化钠，放入100mL去离子水，通过超声溶解。2.4实验方法实验参数选择：拉曼光谱的激光波长为1030nm，激光功率为0~300mW，光谱的扫描范围为100~2500cm-1，分辨率为8~10cm-1，积分时间为1~8s。将200µL的纳米银胶、100µL的0.1%NaCl溶液以及200µL的含核黄素样品溶液依次加入到2mL的石英进样瓶里面，均匀混合之后放到样品池里面进行SERS的采集。设置仪器参数：拉曼光谱的激光波长为1030nm，激光功率为300mW，光谱的扫描范围为2500cm-1，分辨率为10cm-1，积分时间为2s。2.5结果与分析2.5.1荧光分光光度计测量核黄素取浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L的核黄素标准溶液放入荧光分光光度计进行测量，从而获得相应的荧光发射强度。将其作为纵坐标，并且将横坐标设定为标准溶液浓度，将可据此构建出标准曲线，详见图2-1。由计算机处理得到标准曲线方程为y=1015.7x+231.29。在这个同样的条件下测定样品的荧光强度，由计算机经标准曲线计算得到样品中核黄素的浓度为2.54µg/mL。图2-1荧光分光光度计核黄素标准曲线2.5.2饮料中核黄素的SERS分析分别采用标准品的SERS，饮料样品加标的SERS、以金胶为基地的SERS以及空白溶液对照的SERS。如图2-2中的曲线(a)～(d)所示，第一处拉曼特征峰的位置，每个样品都有峰值，由于(a)是作为空白对照的溶液，对照溶液有拉曼特征峰的地方都不可作为核黄素的拉曼特征峰，所以第一个拉曼特征峰位置不是核黄素的拉曼特征峰。曲线(d)是用核黄素标准品配制的溶液，除了第一个拉曼特征峰外，曲线(d)还有另外5个拉曼特征峰，这些都是属于核黄素的拉曼特征峰。曲线(c)是饮料样品加标，与曲线(d)相对比，曲线(c)在731，1347cm-1两个位置的拉曼特征峰能与曲线(d)对应上，但第一个拉曼特征峰，相较于第二个并不显著。故而本文决定将1347cm-1位置所呈现出的拉曼特征峰，当做为考察特征峰来进行分析。曲线(b)是用纳米金胶作为SERS的基底，除了第一处有拉曼特征峰外，其它地方都没有反应，所以纳米金胶对核黄素的拉曼峰没有增强效果，故后期都用纳米银胶作为SERS的基底。图2-2荧光分光光度计核黄素标准曲线(a)空白溶液对照的SERS;(b)金胶为基地的SERS;(c)饮料样品加标的SERS;(d)标准品的SERS2.5.3核黄素标准品的标准曲线如图2-3是不同浓度的核黄素标准品水溶液的SERS，其中a、b、c、d、e分别代表的是浓度为0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L的核黄素标准品水溶液。由图2-3可以看出，随着核黄素标准品水溶液的增加，在拉曼特征峰1347cm-1处的强度呈明显的增强趋势，由此可对标准品溶液的核黄素含量进行定量分析。图2-3核黄素标准品水溶液的标准曲线对不同浓度标准溶液的拉曼特征峰处的强度进行分析，得到的标准工作曲线如图2-4所示。横坐标表示的是核黄素的浓度，纵坐标表示的是标准溶液在拉曼特征峰1347cm-1处采集到的峰强。核黄素标准品溶液的浓度在0.1~10mg/L内，特征峰强度和核黄素浓度呈良好的线性关系，得到线性方程y=2022x+22179，R²为0.9923，最低检测限制可达到0.1mg/L。图2-4核黄素标准工作曲线2.5.4纳米银胶加入量对SERS信号的影响本研究以自制的纳米银胶作为拉曼光谱的增强基地，纳米银胶的加入量会影响SERS的效果影响非常大，所以确定纳米银胶的最佳加入量在本次研究中是必要的考察条件。分别将不同体积的纳米银胶（50、100、150、200、250µL）加入200µL含5mg/L加标饮料和100µL氯化钠混合，然后采集它们的SERS的拉曼特征峰数据。Ⅰ、纳米银胶加入量50µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为8660；Ⅱ、纳米银胶加入量100µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为15080；Ⅲ、纳米银胶加入量150µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为19780；Ⅳ、纳米银胶加入量200µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为22080；Ⅴ、纳米银胶加入量250µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18660；由此可知，如图2-5当纳米银胶从50µL逐步增加到250µL的过程中，混合物溶液在1347cm-1处的特征峰信号强度先增加后降低，并且加入量为200µL时强度达到最大。因此，本研究确定了纳米银胶的最佳加入量为200µL。图2-5银胶量对特征峰信号影响2.5.5待测样品加入量对SERS信号的影响当2.5.4小节确定纳米银胶加入量后，待测加标样品中核黄素分子的变化会对拉曼光谱增强的影响很大。为考察待测加标样品的最佳加入量。实验已知恒定的200µL银胶量，依次添加100、150、200、250、300µL5mg/L加标饮料，将其和100µL氯化钠混合，以采集相应的SERS拉曼特征峰数据。Ⅰ、待测样品加入量100µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为16900；Ⅱ、待测样品加入量150µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为17700；Ⅲ、待测样品加入量200µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18960；Ⅳ、待测样品加入量250µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为15150；Ⅴ、待测样品加入量300µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为12920；由此可知，如图2-6当待测样品从100µL逐步增加到300µL的过程中，混合物溶液在1347cm-1处的特征峰信号强度先增加后降低，并且加入量为200µL时强度达到最大。因此，本研究确定了待测样品的最佳加入量为200µL。图2-6样品量对特征峰信号影响2.5.6氯化钠加入量对SERS信号的影响本文旨在将表面增强基底，设定为已成功制备的纳米银胶，一旦待测分子成功附着于此基底的情况下，银胶将出现凝聚，由于此现象将会对SERS信号，产生极其深远的影响，故而检测时需要添加适量的电解质来活化银胶，所以本实验以氯化钠作为银胶的活化剂，起到防止纳米银胶的团聚效果。实验中固定200µL银胶量，添加200µL含5mg/L加标饮料，并依次添加氯化钠50、100、150、200、250µL，然后采集它们的SERS的拉曼特征峰数据。Ⅰ、氯化钠加入量50µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18140；Ⅱ、氯化钠加入量100µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为20500；Ⅲ、氯化钠加入量150µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为15380；Ⅳ、氯化钠加入量200µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为13230；Ⅴ、氯化钠加入量250µL时，1347cm-1处的特征峰信号强度为13000；由此可知，如图2-7当待测样品从50µL逐步增加到250µL的过程中，混合物溶液在1347cm-1处的特征峰信号强度先增加后降低，并且加入量为100µL时强度达到最大。因此，本研究确定了待测样品的最佳加入量为100µL。图2-7NaCl量对特征峰信号影响2.5.7吸附时间对SERS信号的影响经过研究发现，待测加标样品与纳米银胶基底吸附反应时间会对所采集到的SERS信号强度存在一定的影响。实验中固定200µL银胶量，加入200µL含5mg/L加标饮料，再加入100µL的氯化钠。经过1、2、3、4、5min反应后，采集它们的SERS的拉曼特征峰数据。Ⅰ、吸附时间为1min时，1347cm-1处的特征峰信号强度为21540；Ⅱ、吸附时间为1min时，1347cm-1处的特征峰信号强度为20070；Ⅲ、吸附时间为1min时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18550；Ⅳ、吸附时间为1min时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18260；Ⅴ、吸附时间为1min时，1347cm-1处的特征峰信号强度为18120；由此可知，如图2-8当待测样品和纳米银胶基底吸附时间为1min时，混合物溶液于1347cm-1位置的特征峰信号强度最佳，并且随着吸附时间的增加该强度不断降低。因此，本研究确定了吸附的最佳时间为100µL。图2-8吸附时间对特征峰信号影响2.5.8加标饮料溶液的标准曲线以及预测结果本实验基于最佳实验条件采集含核黄素浓度a、b、c、d、e依次为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0mg/L加标饮料样品的SERS光谱图，如图2-9所示。可以看出随着加标饮料样品的核黄素浓度的上升，特征峰1347cm-1处的峰强也跟着上升，所以从特征峰的强度来分析加标饮料样品溶液中所含核黄素的浓度。图2-9加标饮料标准曲线研究加标饮料样品溶液中所含核黄素的浓度在0.1~10mg/L，得到加标饮料溶液的的标准工作曲线如图2-10所示。横坐标表示的是核黄素的浓度，纵坐标表示的是标准溶液在拉曼特征峰1347cm-1处采集到的峰强。核黄素标准品溶液的浓度在0.1~10mg/L内，特征峰强度和核黄素浓度呈良好的线性关系，得到线性方程y=1075.3x+13386，R²为0.9907，最低检测限制可达到0.1mg/L。图2-10加标饮料工作标准曲线3结论与展望3.1结论在此研究过程中，旨在借助于表面增强拉曼技术的作用，针对存在于功能饮料当中的核黄素实际含量，进行相对迅猛的精准检测。以自制纳米银胶为增强基底，加入氯化钠进行活化，确定了研究饮料溶液中核黄素的最佳特征峰的位置为1347cm-1。对纳米银胶、待测样品、氯化钠以及吸附时间进行了分析，得出了最佳实验条件。同时根据特征峰的峰值强度与饮料中核黄素含量建立了标准工作曲线，浓度范围在0.1~10mg/L内具有良好的线性关系，R²为0.9907，最低检测限制可达到0.1mg/L。除了用SERS检测饮料中的核黄素，还采用了比较常见的荧光分光光度计进行检测，同样检测出饮料中含有核黄素。综上所述，利用SERS技术检测饮料中的核黄素是准确可靠的。3.2展望现在我们建立了一种简便的测定饮料中核黄素的方法，希望在不久的将来可以有一些拥有更高深理论知识的学者、科学实验者们展开更系统、更全面、更深入的研究，然后把它广泛的被饮料和食品公司所采用，用于饮料及其加工品生产的检测。

谢辞经过近一个学期的学习和探索，我的毕业实验和论文顺利完成了。回顾过去的这段日子，心中真是五味杂瓶。首先，我要感谢我的毕业实验指导老师马春华讲师，非常感谢春华老师根据我的综合情况从选题、资料收集、实验方案设计、实验操作到最后的论文完成的每个环节给予的指导。在完成整个毕业实验及论文的过程中马老师在自己学习和工作的同时花费了大量的精力认真耐心的给我指点。以此同时，感谢我们学校实验室的管理员老师与同学，给我们提供了很大的帮助，其他老师也经常来给予我一些意见和建议，在此表示感谢。此外要感谢的是这篇论文所涉及到的各位研究者，以及实验仪器设备的厂家。最后，我要感谢我的亲友和舍友在我做实验期间对我的包容与关心支持我，在今后我会更加努力，以积极乐观的态度面对人生。

参考文献[1]王海波.表面增强拉曼光谱用于食品检测的研究进展[J/OL].食品工业科技:1-9[2019-04-21]./kcms/detail/11.1759.TS.20190415.1210.016.html.[2]罗丹,周光明,陈蓉,罗庆红,郝光辉.表面增强拉曼光谱法分析软饮料中的阿斯巴甜[J].分析测试学报,2019,38(03):328-333.[3]赵亚然,谢微.双