枯草芽孢杆菌的分离培养及初步应用

枯草芽孢杆菌的分离培养及初步应用

半个世纪以来，化学农药的防治和病虫害预防对农业生产起了重要作用，但长期以来，化学农药被多次不适当使用，导致了许多问题。枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis,简称BS)是内生芽孢的革兰氏阳性细菌,其菌体在生长过程中产生枯草菌素、杆菌肽等抗菌活性物质,对各种致病菌有明显的抑制作用。由于其能产生耐热抗逆的芽孢,对菌剂的生产、剂型加工及其在环境中的存活、定殖与繁殖都十分有利。因此它是一种理想的生防微生物,在植物病害的生物防治中得到了广泛的应用。本试验以枯草芽孢杆菌为材料进行透射电镜样品制备和观察,为BS的生物防治工作提供一些基础理论依据。1梯度丙酮ph值枯草芽孢杆菌为华中农业大学电镜平台实验培养。黏合剂:2%琼脂糖。固定液:戊二醛(2.5%),1%锇酸。缓冲液:磷酸缓冲液(PBS,0.1mol/L,pH7.4)。脱水剂:30%、50%、70%、80%、90%、100%的梯度丙酮。包埋剂:SPI812环氧树脂(沿用Luftl1961年的配方,A液、B液体比1:9)。2实验方法2.1琼脂糖的制备对枯草芽孢杆菌菌种平板分离纯培养,然后接种到三角瓶中NYDA(营养肉汤8g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,水1000mL)液体培养基培养3d。待长到密度较高时,收集到2mL离心管中,3000r/min离心2min得到细菌团。加热2%琼脂糖至溶解,然后待其温度降到37℃左右,将融解的琼脂糖加入离心管中,包裹住细菌团。待琼脂糖凝固后,将多余的琼脂糖切去,并将琼脂糖包裹的细菌团切成1mm3大小的块状,放入2mL离心管。2.2前安装2.5%戊二醛的PBS(0.1mol/L,pH7.4)溶液加入离心管中,4℃固定过夜。2.3洗衣粉1.5mLPBS(0.1mol/LpH7.4)加入离心管中,室温下漂洗3次,每次15min。2.4固定后的固定每个离心管中加0.5mL1%锇酸室温作用2h。2.5洗衣粉1.5mLPBS(0.1MpH7.4)加入离心管中,室温下漂洗3次,每次15min。2.6梯度丙酮作用依次将1.5mL的30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度丙酮加入离心管中,室温作用30min。最后纯丙酮室温3次脱水,每次30min以彻底脱去样品块中的水分。2.7dmp-30包埋渗透:丙酮-包埋剂(体积比3:1)作用8h→丙酮-包埋剂=(体积比1:1)作用12h→丙酮-包埋剂(体积比3:1)作用12h→纯包埋剂(不加DMP-30)作用12h→包埋剂(加DMP-30)作用12h,整个过程均在40℃进行。包埋:向21孔硅化包埋板每孔中先加入少量包埋剂(加DMP-30),用牙签挑出样品,放入包埋孔的两端,最后将每孔加满。将包埋板放入烘箱中聚合,45℃预聚合24h,再60℃完全聚合24h。2.8包埋材料的下底边将聚合好的包埋块放入专用的样品夹中,在解剖镜下用单面刀片修去顶端和组织周围多余的包埋剂,并使包埋材料呈金字塔形。修出的材料面上下底边要平行,边角要锐。LeicaUC6超薄切片机进行超薄切片,切片厚度60nm,切片成带后,用眉毛笔将带状切片捞到以Formvar(聚乙烯醇缩聚甲醛,0.2%)作为支持膜的铜网上,放入切片盒中,自然干燥。2.9醋酸铅的染色在一培养皿中灌注蜡,做成蜡槽,待凝固。在培养皿盖上涂抹凡士林,密封蜡盘。取饱和醋酸铀溶液滴入蜡槽中,然后用尖头镊子夹取铜网,将有材料的一面朝下放在染色液中,染色30min。取出铜网,经过3次双蒸水漂洗后,按照同样方法进行柠檬酸铅染色10min。取出铜网,用滤纸吸干多余的水,放入切片盒中。2.10超声切片观察使用H7650透射电镜,加速电压80kV观察超薄切片。用Gatan832digitalcamera成像,获得枯草芽孢杆菌的超微结构。3超微结构的观察按照上述步骤进行实验,获得如图1所示结果。图片中枯草芽孢杆菌的超微结构清楚,特别是细胞壁为3层。细胞内的核区不能明显分辨出,可能是菌处于生长旺盛期,核区分散不呈团状。a、b、d:菌体纵切面bar=0.2μmc:菌体增殖时横切面bar=0.5μm4透射电镜观察c对于散在细胞的细菌,在透射电镜样品制备过程中很难成块。故采用琼脂糖固定成块状,为接下来的漂洗、后固定、脱水、渗透和包埋提供了极大的方便。从而不必每一步都要离心使样品成块。通过对枯草芽孢杆菌透射电镜制样的摸索,找到了一种适合散在细胞、细菌的透射电镜制样方法-琼脂糖包埋成块法。琼脂糖包埋后,使用手术刀片切除多余的琼脂糖并将样品切成1mm3大小的小块。样品的体积一定要小,否则不但会影响后固定效果而且会导致渗透困难,从而致使样品得不到很好的固定或超薄切片无法进行,最终导致实验失败。脱水过程中,若当天不能完成渗透等步骤,样品可以在70%丙酮中过夜,不能放在100%丙酮中