甘蔗茎尖脱毒技术研究进展

甘蔗茎尖脱毒技术研究进展

0种植甘蔗脱毒健康种苗甘蔗是甘蔗的无性繁殖品种。与许多无性繁殖物种（如红薯、香蕉、葡萄等）一样，经过多年的连续栽培，品种多样性容易退化。由于管理技术和其他因素，甘蔗种植场地的损伤和流行。甘蔗产业最大的威胁来自甘蔗病害,目前危害甘蔗生产的主要病害有凤梨病、赤腐病、黑穗病、花叶病、宿根矮化病等,其中甘蔗宿根矮化病、花叶病在世界范围内广泛发生,是极难防治的顽固病害。甘蔗花叶病主要是由甘蔗花叶病毒(SCMV)和高粱花叶病毒(SrMV)引起(陈炯等,2001;Alegriaetal.,2003;李文凤等,2007),病毒株系种类多,变异较大(Oerteletal.,1997;Handleyetal.,1998;Hemaetal.,1999;Alegriaetal.,2003;秦碧霞等,2007)。据调查,华南各地尤其是广西旱地甘蔗花叶病的发病率达到30%以上,产量损失3%~50%。甘蔗宿根矮化病(Ratoonstuntingdisease,RSD)是由一种杆状细菌(Clavibacterxylisubsp.Xyli,Lxx)引起的,RSD蔗株平均感染率高达50%左右,造成甘蔗减产10%~37%,在干旱情况下减产可达60%,蔗糖分降低0.5%(绝对值)(Comstock,2002;邓展云等,2004;沈万宽等,2007)。广西农业科学院甘蔗研究所对来自广西不同地区的数百个甘蔗样品进行检测,结果发现几乎所有的甘蔗商业品种均检测出宿根矮化病病菌(邓展云等,2003)。防止甘蔗花叶病和宿根矮化病的发生和蔓延,对甘蔗产业的稳健发展具有重要意义。虽然国内外学者对这两种甘蔗病害的鉴定、诊断及防治等方面进行广泛研究,但目前仍未研究出特效防治药剂以及较理想的防治方法。由于甘蔗病害如黑穗病、宿根矮化病等主要是通过种苗传播,因此,预防甘蔗种性退化、获得无病毒健康植株的最有效方法是采用茎尖和愈伤组织培养脱毒种苗。甘蔗脱毒健康种苗除株高、生长速度、分蘖率等优于未脱毒甘蔗外,还具有明显的增产增收优势:一是种茎用量少,脱毒健康种苗种茎较小,6.0t左右种茎可种植1ha大田,明显减少了种苗用量和种苗运输成本;二是产量高,与未脱毒种苗相比,种植甘蔗脱毒健康种苗,平均增产20%,大约每公顷增产15t,最高的增产达40%以上;三是蔗糖分略有提高,脱毒甘蔗蔗糖分一般提高0.5%~1.0%(绝对值)。因此,在投入成本不变的情况下,种植甘蔗脱毒健康种苗,每公顷甘蔗可为蔗农增收3000多元,增产增效十分显著。本文通过对近年甘蔗茎尖组织培养脱毒技术的应用及影响其脱毒效果的因素进行概述,以期为生产优质脱毒种苗、保证蔗种源头质量提供参考。1植物茎尖的培养组织培养技术是农业高新技术中最重要、最活跃的领域之一,它不仅是农业可持续发展的基础,而且是生物技术中应用最广、最具现实意义的领域,被誉为农业发展史上的第四次绿色革命。国内外许多研究结果已证明茎尖组织培养有一定的脱毒效果,茎尖培养脱毒原理是利用病毒在植物体内分布不均匀性,越靠近茎顶端分生区域,病毒浓度也越低,即根尖和芽尖的分生组织含病毒量少或不含病毒。因此,根据茎尖存在无病毒区,在无菌条件下切取植物茎尖进行离体培养,可以获得不带病毒的植株。我国植物快速繁殖和无病毒种苗生产研究始于20世纪70年代,近年来,茎尖培养脱毒技术已被广泛应用于各种作物的脱毒培养,例如马铃薯(赵海峰等,2006)、甘薯(孟令文,2010)、辣椒(文锦芬等,2002)、大蒜(海燕等,2006)等,马铃薯无毒种薯和甘蔗无毒种苗已在生产上大面积种植。快速大量繁殖甘蔗试管苗,主要有两种方法:一种是诱导嫩叶外植体产生愈伤组织(含愈伤组织胚性细胞团发生途径),由愈伤组织分化成植株(Danielaetal.,2007);另一种是培养茎顶端生长点附近的芽(顶芽、腋芽),使之大量分蘖繁殖,繁殖一定数量后,诱导芽长出根,形成完整植株(Lakshmananetal.,2006)。相对于愈伤组织培养,茎尖培养方法的效果更好,茎尖顶芽的组织培养变异性小,且繁殖速度更快。采用无病种苗是防止蔗种带病传播的最有效措施,其中健康种苗已在巴西、古巴、美国、澳大利亚等广泛应用。目前,以甘蔗幼嫩茎尖组织作为外植体的茎尖离体培养技术结合热处理,可以获得去除甘蔗花叶病、宿根矮化病和白叶病的脱毒健康种苗,并使甘蔗种苗比普通种苗的产量提高。游建华等(2001)研究报道,采用幼嫩茎尖组织作为外植体的茎尖离体培养技术结合热处理,获得健康脱毒的甘蔗种苗在生产上可使甘蔗增产20%~40%,蔗糖含量增加0.5%以上(绝对值)。2甘蔗茎分散处理技术的应用2.1茎尖中的应用甘蔗是第一个经组织培养获得组培苗的禾本科植物。巴西、古巴等国早在20世纪70年代末即对甘蔗健康种苗进行了研究,到80年代中期,健康种苗生产已获得成功,并在甘蔗生产上推广使用,至今,巴西、古巴等国的90%蔗区已实现甘蔗用种健康、无毒化。巴西已在全国建立甘蔗脱毒健康种苗生产繁殖体系,生产用的种苗均为经过脱毒的健康种苗,蔗农不能随便留种,且每个糖厂都有自己的健康种苗生产基地(游建华等,2001)。我国对甘蔗脱毒苗的研究起步较晚。广西农业科学院甘蔗研究所从1998年开始对当时广西蔗区的主栽品种桂糖11号等进行茎尖脱毒健康种苗的研究(肖关丽等,2003)。贤武等(2000,2007)、曾慧等(2003)、肖关丽等(2003)、黄诚梅等(2004)、周明强等(2006a)采用热处理结合茎尖分生组织脱毒技术对甘蔗进行脱毒研究,但茎尖培养成功率均不高且结果存在反复的问题。因此,利用热处理结合茎尖分生组织培养技术体系还不够完善,许多问题有待解决,其中茎尖培养污染率大、酚害严重,致使茎尖死亡,培养成功率低。针对在茎尖培养阶段由于污染率和褐变率高导致培养成功率较低的问题,刘丽敏等(2009a)在甘蔗热处理、茎尖解剖、接种等阶段设计不同试验进行研究,结果表明,不同甘蔗品种在热处理时需要不同的水浴温度和时间;在茎尖解剖前,使用75%酒精处理可以减少酚害污染,PVP还对其生长有促进作用等。刘丽敏等(2009b)利用新型间歇浸没式生物反应系统(TIBs)在培养基配方、接种数量、蔗糖浓度及品种差异等方面对甘蔗脱毒组培苗快繁进行研究,结果表明,PP333及6-BA+PP333均能促进组培苗分化,增殖率较高且生长整齐,可进入下一阶段培养;GA3浓度为1.0mg/L的伸长培养效果最好;每升培养液接种量为20株时的增殖率最高;培养基蔗糖浓度以20g/L为宜。利用该系统对ROC16和ROC22两个甘蔗品种的脱毒苗经过3个阶段的培养,ROC16增殖率达40倍,每瓶得苗800株苗左右;ROC22增殖率为30倍,每瓶苗的数量达600株。李松等(2010b)以新台糖22号为材料,比较茎尖胚状体、茎尖与腋芽3种分化成苗繁育方法在不同时期接种、不同激素水平下的组培苗增殖速度、苗素质及脱毒效果,结果表明,组培苗繁殖速度以茎尖胚状体分化苗最快,培养基以6-BA1.5mg/L+NAA0.01mg/L增殖效果最好;不同处理间组培苗生根及移栽成活率差异不显著,生根率茎尖胚状体苗75.3%、茎尖苗76.9%、腋芽苗76.6%,移栽成活率茎尖胚状体苗94.8%、茎尖苗95.4%、腋芽苗95.1%,生根培养基以NAA7.5mg/L+ABA2.5mg/L最好;去除RSD、花叶病方面,以茎尖胚状体苗最好,RSD去除率95%、花叶病去除率100%,茎尖苗RSD去除率70%、花叶病75%,腋芽苗未能去除RSD、花叶病。应用茎尖胚性细胞再生植株,脱毒效果好,繁殖速度快,可克服目前脱毒苗生产中试管苗扩繁量小、成本高的难题。刘红坚等(2008)以ROC22茎尖脱毒苗为材料,研究NAA、多效唑、蔗糖、温度等几个因素对甘蔗茎尖脱毒组培苗在生根阶段的影响,结果表明,在甘蔗生根培养基中加入NAA4.0~4.5mg/L,多效唑2.0~2.5mg/L,蔗糖40g/L,温度在25~30℃的条件下培养生根最好,并能显著提高组培苗移栽成活率。李松等(2010a)以聚丙烯薄膜袋为培养容器,对新台糖22号脱毒组培苗进行袋装室外生根培养,比较不同季节和不同光照条件下袋装组培苗室外培养的污染率、根系与叶片生长及移栽成活等情况,结果表明,袋装组培苗室外生根不同培养时间污染率只有3.5%~4.7%,低于瓶装室外生根培养8.0%~14.5%,差异达极显著水平,不同光照条件水平及培养环境温度高低对组培苗生根率、每株苗根系数量等影响不显著,高温季节对叶片生长有一定影响,以70%光照条件的生根苗室外移栽成活率最高;袋装室外培养生根苗丛栽后苗生长较快,苗素质好;应用聚丙烯薄膜袋为培养容器对甘蔗脱毒组培苗进行室外生根培养,可提高生根苗的素质和移栽成活率。2.2种植甘蔗健康苗种的培养曾慧等(2003)利用茎尖离体组织培养与热水处理相结合的技术方法,进行3个甘蔗品种桂糖11号、拔地拉(黑皮果蔗)、粤糖63/237脱毒健康种苗生产研究,结果表明,该方法生产的无病无毒健康种苗在出苗、分蘖、生长速度、株高、茎径、有效茎及产量等方面与对照相比有均显著差异,蔗茎增产幅度达26.65%~69.39%;认为蔗芽过于幼嫩不适合作热水处理。桂糖11号、拔地拉(Badila)的脱毒健康种苗与常规种植田间比较试验表明(曾慧等,2005),在新植连作时,无论是否是健康种苗繁殖的后代,每茬均进行热水脱毒处理,其效果优于传统的常规种植,桂糖11号蔗茎增幅45.28%~51.19%,拔地拉蔗茎增幅61.49%~66.22%;与前茬健康种苗种植出的种茎不再进行热水处理就直接下种相比,每茬下种前的种茎均进行热水处理后的种植效果较好,桂糖11号蔗茎增幅2.92%~6.78%,拔地拉蔗茎增幅0.48%~0.66%;而后者又比传统常规种植方法好,桂糖11号蔗茎增幅38.50%~48.27%,拔地拉蔗茎增幅61.01%~65.56%;上一茬已做过热水处理、茎尖脱毒组培苗种植,新植一年后的宿根蔗桂糖11号蔗茎增幅也比对照高32.05%~40.86%;各个处理的蔗糖分均比对照有所提高,增幅0.91%~1.71%(绝对值)。周明强等(2006b)对F134、黔糖4号、Badila(果蔗)3个品种脱毒种茎和非脱毒种茎生产性能进行比较,结果表明,3个品种脱毒种茎的出苗率、分蘖率、月株高和月生长速均高于非脱毒种茎,株高、茎径、有效茎、节间长、田间锤度也比非脱毒种茎高,说明甘蔗脱毒种茎较非脱毒种茎有较好的生产性能。杨本鹏等(2010)对甘蔗健康种苗3季新植、3季宿根的农艺性状、产量和蔗糖分含量进行了田间比较试验,结果表明,种植脱毒健康种苗可以使甘蔗单位面积产量提高23.0%~40.2%,蔗糖分含量提高0.51%~1.01%(绝对值);初步认为分蘖率、宿根发株率和成茎率高是甘蔗健康种苗增产的主要因素。沈万宽等(2009)进行了粤糖00-236健康种苗与其普通种茎苗新植田间比较试验,结果表明,粤糖00-236健康种苗较其普通种茎苗蔗茎产量显著增产10.6%和9.1%(大面积示范),甘蔗蔗糖分提高0.26个百分点,且萌芽快,萌芽率较普通种茎苗显著提高22.94个百分点,粤糖00-236健康种苗的公顷有效茎数达11400条(达极显著水平),分蘖率高3.0个百分点,但两者的茎径、生长速率及茎长差异不明显,表明粤糖00-236新植健康种苗具有显著的增产效果,蔗糖分也略有提高。3影响甘蔗茎尖提取效果的因素3.1叶原基对组培苗期生长和发育的影响茎尖培养中最主要的影响因素是茎尖大小,外植体大小不但会影响植株的再生能力(呈正相关),而且会影响茎尖的脱毒效果(呈负相关)。许莉萍等(1993,1994)在脱除甘蔗花叶病毒研究中,采用2.0mm的外植体,其后代发病率为46%。Mishra和Rao(2011)在尝试使用茎尖分生组织培养技术生产UP01235和UP0097两个甘蔗品种的脱甘蔗黄叶病毒(SCYLV)脱毒组培苗时发现,当以1.5mm茎尖进行培养时,获得的两个甘蔗品种的组培苗在温室种植,在生长期间未发现存在黄叶病毒,说明黄叶病毒已被消除;当以超过1.5mm的茎尖为外植体时,所获得的组培苗存在黄叶病毒。除外植体大小外,叶原基的存在与否也直接影响茎尖的成苗率与脱毒率。叶原基能够向分生组织提供少量茎尖生长和分化所需的激素和养分,茎尖越大,带有的叶原基越高,而叶原基越多,脱毒率就越低。在技术上,切取的茎尖越小,脱毒效果越好,但是茎尖培养成活率会降低。综合考虑成苗率和脱毒率,以切取0.5~1.0mm茎尖(带1~2个叶原基)进行培养为宜。3.2组织培养和热处理茎尖培养常与热处理相结合,因为热处理具有钝化病毒、阻碍病毒进入茎尖分生组织的作用。曾慧等(2003,2005)研究结果证明,通过高温水浴处理和茎尖离体组织培养或者两种处理相结合的脱毒技术,可以去除甘蔗种株上的花叶病和宿根矮化病等病原物,从而获得健康种苗。茎尖苗的脱毒率随温度的提高和处理时间的延长而提高,方法有两种:一是茎尖培养前把蔗茎经过高温短时间(52℃热水处理30min后再38℃处理10~15d)热处理;二是在甘蔗继代培养过程中进行为期30d的热处理,即将培养物放入温度为38℃的光LRH-250-G的光照培养箱中。第二种方法虽不如前一种,但简单易行,处理数量大(刘丽敏等,2009a)。3.3其他作物