低含水量饲料对水生椭粉黑质路疫苗生长发育的影响

低含水量饲料对水生椭粉黑质路疫苗生长发育的影响

黑水虱是一个古老的环境昆虫。它以失败的有机物质和粪便为食（迈希，196）。这是一个重要的环境昆虫。幼虫取食动物粪便后,不仅可以减少粪便堆积量和臭气产生(Sheppardetal.,1994),还可以控制家蝇滋生(Tomberlinetal.,2002a)、减少粪便中大肠杆菌Escherichiacoli和沙门氏菌数量(Ericksonetal.,2004;Liuetal.,2008)。幼虫还可以处理咖啡加工的废弃物(Lardé,1990)及餐厨垃圾等。另外,处理垃圾及粪便的副产品(幼虫和预蛹)含有丰富的蛋白和脂肪,能够用来生产具有较高经济价值的动物饲料(Yuetal.,2009),也可以替代配合饲料中的大豆粉和鱼粉用于养鸡、养猪和养鱼(Hale,1973;Newtonetal.,1977;BondariandSheppard,1981;St-Hilaireetal.,2007),还可生产生物柴油(Zhengetal.,2012)缓解能源危机。因此,利用黑水虻处理粪便技术是一条集环境化和资源化于一体的技术。但是,目前关于黑水虻生物学和生态学的相关研究较少,人们对其生长发育的规律了解甚少,大大制约了黑水虻的生产应用。研究表明,黑水虻的生长发育受温度(Tomberlinetal.,2009)、饲料类型(Tomberlinetal.,2002a,2002b;Muersetal.,2008)、光照(黄苓,2008)及饲料中添加微生物的影响(喻国辉等,2010;Yuetal.,2011)。课题组野外调查发现,潮湿物料中生长的黑水虻幼虫较干燥物料中幼虫体型大,活力强。且Kilpatrick和Schoof(1959)研究表明,含水量对黑水虻控制家蝇滋生产生显著影响。何国宝(2010)的研究显示,人工饲料含水量70%~80%时最适合黑水虻的生长发育。本实验以70%含水量为对照(Tomberlinetal.,2002a),研究将饲料含水量降至30%和50%时黑水虻幼虫存活率、不同阶段幼虫体重、预蛹率、雌雄成虫体长、羽化率以及不同阶段发育历期与70%含水量饲料饲养黑水虻的差异,以获得饲料中不同含水量对黑水虻生长发育各生物学参数的影响,为进一步优化黑水虻的人工饲养条件提供依据,并为利用黑水虻集约化处理畜禽粪便及其他应用提供理论参考。1材料和方法1.1紫花苜蓿饲料利用广东珠海本地黑水虻资源建立种群,于珠海市现代农业发展中心使用Tomberlin等(2002a)筛选的紫花苜蓿人工饲料饲养,传代5代。1.2董尚智我国农业发展中心纳豆芽胞杆菌Bacillusnatto,由珠海市现代农业发展中心董尚智研究员提供。使用LB培养基摇瓶发酵,140r/min27℃培养72h,OD600达到1.2以上用于接种发酵。1.3工饲料配方的确定紫花苜蓿饲料:根据Tomberlin等(2002a)配方配置。发酵豆粕饲料:在紫花苜蓿人工饲料配方的基础上用等量豆粕替代饲料中紫花苜蓿,然后用纳豆芽胞杆菌发酵。发酵时将1000g人工饲料加入1500mL水后,121℃高压蒸汽灭菌,冷却后,接入100mL摇瓶培养的纳豆芽胞杆菌,置于塑料盆中,拌匀后室温发酵1周,发酵产物储存于低温冰箱备用。1.4发酵饲料含水量测定分别称取9份约10g的发酵饲料,80℃烘干至恒重,计算发酵后饲料含水量。按上述条件发酵获得的人工饲料经测定含水量为67.89%±0.26%。然后,将发酵饲料烘干每烘2h称量一次,直至含水量接近30%,实际测得含水量为31.89%±0.003%。50%和70%水分的饲料均在烘干饲料的基础上通过添加蒸馏水配置而成。1.5不同投喂量的饲料对紫花苜蓿干物质的影响收集1000粒同日产黑水虻卵(产卵时间相差不超过3h),将卵置于直径12cm、高10cm饲养盒中,盒盖密封避免饲料受到环境湿度影响,于人工气候箱中(27℃,RH80%,光周期14L∶10D)保湿孵化后加入紫花苜蓿人工饲料饲养4d。将4日龄幼虫接入含水量分别为30%,50%和70%的发酵人工饲料中饲养,每个处理3个重复,每个重复100头幼虫。饲养时分3次投料,第一次投料时,按每头0.1g干物质计算,每组喂10g干物质,其中30%含水量14.3g,50%含水量20g,70%含水量33.3g,第4天按照同样的投喂量补充一次饲料,第8天加倍补充饲料,实验结束时,每个重复提供的干物质均为40g。幼虫饲养条件同卵孵化条件。1.6数据收集和统计分析1.6.1各幼虫平均体重测定每2日针对不同处理的不同重复,随机挑取30头幼虫,按每10头一组组合,称量10头幼虫总重,计算单头幼虫平均体重(称量后放回饲养盒)。当50%幼虫预蛹时,停止幼虫称重。对获得的数据通过方差分析,比较不同处理间同一发育阶段幼虫平均体重差异。1.6.2纸吸干预蛹重量幼虫开始预蛹时(6龄幼虫,体色变褐,不进食),每日挑取预蛹,滤纸吸干表面水分后,单头称量预蛹重量,用于比较不同处理预蛹重量的差异,并计算每日预蛹率、每日累计预蛹率、预蛹持续时间(全部幼虫预蛹所需时间)。根据每日预蛹率和每日累计预蛹率计算不同处理每日平均预蛹率和每日平均累计预蛹率。1.6.3各成虫的石化成虫性别、体长计算将收集自不同处理不同重复的预蛹分别置于相应编号的饲养盒中,待其开始羽化后每日记录当日不同处理羽化成虫性别及体长,并分别计算雌雄成虫每日羽化率、每日累计羽化率、雌雄成虫羽化过程持续时间及成虫总羽化率,并通过方差分析比较其差异。根据每日羽化率和每日累计羽化率计算每日平均羽化率和每日平均累计羽化率,并用每日平均羽化率和每日平均累计羽化率作图,并获得羽化率与羽化持续过程的函数关系。1.6.4预蛹数/100100%每个重复幼虫存活率的计算公式为:幼虫存活率=预蛹数/100×100%;由于预蛹的化蛹率为100%,因此每个重复的成虫羽化率计算公式为:成虫羽化率=羽化成虫总数/预蛹数×100%。1.6.5养殖周期参数的方差分析以卵孵化当日为幼虫的1日龄计为繁殖周期的第1天,统计预蛹开始时间、预蛹结束时间、预蛹持续时间、雌雄成虫开始羽化时间、雌雄成虫结束羽化时间、雌雄成虫羽化过程持续的时间、从幼虫孵化到成虫全部羽化所需的时间等养殖周期参数,并进行方差分析。以幼虫日龄为横坐标绘制幼虫增重曲线、每日平均预蛹率曲线和每日平均累计预蛹率曲线,以第1头成虫羽化的时间为羽化持续过程第1天,绘制雌雄成虫每日平均羽化率曲线和每日平均累计羽化率曲线。1.6.6数据库的绘制对所收集的数据使用SPSS13.0数据分析软件开展方差分析和LSD多重比较,得到的数据使用Excel作图工具绘制图形。其中方程使用Excel绘图工具中的趋势线模拟获得。2结果与分析2.1饲料含水量对黑水昆虫生长发育的影响2.1.1幼虫饲养及预蛹效果饲料含水量对黑水虻幼虫增重影响明显(图1),含水量为70%人工饲料饲养幼虫平均体重显著高于含水量为50%和30%饲料饲养幼虫的体重,饲料含水量为30%时幼虫不能正常生长发育,饲养至第13天时大部分幼虫死亡。含水量为70%人工饲料饲养幼虫至13d时有50%的幼虫预蛹,比含水量为50%人工饲料饲养幼虫提早6d实现50%幼虫预蛹。50%含水量饲料饲养幼虫存活率为91.33%±4.81%,与70%含水量饲养幼虫存活率(100%)相比无显著差异(P<0.05)。2.1.2“4.5”饲料饲养的确保了材料中的东南角不同含水量饲料饲养的黑水虻预蛹平均体重差异显著,含水量50%饲料饲养黑水虻预蛹平均重量为0.0793±0.0017g,显著小于含水量70%饲料饲养的黑水虻预蛹平均重量0.1550±0.0023g(P<0.05)。2.1.3饲料含水量对保幼期的影响如图2(A)所示,含水量70%的饲料饲养黑水虻在幼虫日龄为18d(发酵饲料饲养13d)时开始预蛹,次日达到预蛹高峰,随后预蛹率逐渐下降,整个过程持续10d,而含水量50%饲料饲养黑水虻在幼虫日龄为23d时开始预蛹,比70%含水量饲料饲养黑水虻延长5d,预蛹高峰出现在开始预蛹后的第3天,整个预蛹过程持续18d,每日预蛹率有较大波动;以幼虫日龄为横坐标、每日平均累计预蛹率为纵坐标获得累计预蛹率曲线图(图2:B)。每日累计预蛹率(y)与预蛹过程持续时间(x)间的函数关系分别为:可以根据上述函数关系和预蛹开始时间预测完成预蛹可能需要的时间,为以后黑水虻的大规模生产实践提供时间参考。降低饲料含水量可显著延长幼虫的发育时间(表1)。含水量70%的饲料饲养黑水虻第一头预蛹出现的时间为18日龄,而含水量50%的饲料饲养黑水虻滞后5d开始预蛹,滞后14d结束预蛹,预蛹历期延长8d。如果以70%幼虫预蛹结束养殖周期,则70%含水量饲养可以缩短周期8d;如果以90%幼虫预蛹结束养殖周期,则70%含水量可缩短周期11d,大大节约了养殖成本。2.2食物含水量对黑水的产生影响2.2.1饲养水土流失饲料对类重虫虫体长的影响不同含水量饲料饲养的黑水虻成虫体长差异显著(表2)。同一含水量饲料饲养的黑水虻雄虫体长显著短于雌虫;50%含水量饲料饲养的黑水虻成虫体长显著短于70%含水量饲料饲养成虫;不同含水量饲料饲养的黑水虻成虫羽化率差异不显著(P>0.05)(表2)。2.2.2日进程及美国法上的成虫石化率50%含水量饲料饲养黑水虻成虫在羽化起始时间、羽化持续时间和羽化速率方面与70%含水量饲料饲养成虫相比均差异明显(图3)。含水量50%饲料饲养黑水虻雄虫在发酵饲料饲养至第33天开始羽化,羽化持续18d,比含水量70%饲料饲养黑水虻雄虫滞后5d羽化,且羽化持续时间延长5d;50%含水量饲料饲养黑水虻雄虫每日平均羽化率出现2个明显峰值,分别为雄虫开始羽化的第4天及第8天(图3:A),而含水量70%饲料饲养黑水虻雄虫每日平均羽化率的2个峰值分别在羽化的第4天及第7天;含水量50%饲料饲养黑水虻雌虫在第35天开始羽化,比雄虫延长2d,比含水量70%饲料饲养黑水虻雌虫滞后5d开始羽化,羽化时间持续18d,比含水量70%饲料饲养黑水虻延长5d;50%含水量饲料饲养黑水虻雌虫羽化的峰值出现在开始羽化的第8天,而70%含水量饲料饲养黑水虻雌虫羽化的峰值出现在开始羽化第6天,均在雄虫羽化高峰之后1-2d出现(图3:C);对成虫(不区分雌雄)的每日平均羽化率作图,得出的曲线图(图3:E)与雄虫每日平均羽化率相似,说明成虫每日羽化率的变化主要受雄虫羽化情况影响;由图3(B,D,F)可以看出,雌雄虫的每日累计羽化率及成虫每日平均累计羽化率均接近S型曲线,羽化的过程表现出3个不同的特征,即开始羽化的1~2d为羽化的开始期,曲线上升缓慢,之后的6~7d为羽化的加速期,大部分成虫在这个时期羽化,随后羽化接近尾声,曲线表现为较为平稳并最终接近100%,根据曲线特点,获得每日平均累计羽化率(y)与羽化过程持续时间(x)函数:函数的定义域为自然数,函数的值域为[0,1]。通过上述函数可以为黑水虻集约化处理粪便提供雌雄成虫羽化时间及推算集中收卵时间,以节约成本。饲料含水量对成虫发育历期的影响如表3,50%含水量饲养的黑水虻成虫发育也显著滞后于70%含水量饲料饲养黑水虻。3不同含水量饲料对科学饲养水蚤期的影响本实验针对饲料含水量对黑水虻生长发育的影响开展研究,结果表明,饲料的含水量对黑水虻生长发育具有明显的影响,饲料含水量为30%时黑水虻的幼虫不能正常生长发育;饲料含水量为50%和70%时黑水虻能够正常生长发育,但50%的含水量明显抑制了黑水虻生长发育。50%含水量饲料饲养的黑水虻幼虫体重、成虫体长均显著低于70%含水量饲料饲养黑水虻(P<0.05);各发育阶段也比70%含水量饲料饲养黑水虻延后开始或滞后结束,这个结果与何国宝(2010)类似,人工饲料含水量70%~80%最适合黑水虻的生长。我们推测,饲料含水量可能通过影响幼虫对饲料中营养的摄入效率来影响其生长发育,是否如此还需进一步研究。对发育历期统计的结果显示雄虫羽化比雌虫提前2d,且雄虫的体长小于雌虫,这与Tomberlin等(2002a)的研究结果一致。May(1961)对黑水虻的研究显示,在实验室内卵孵化后18d进入6龄幼虫即预蛹,本研究的结果显示,在含水量70%的发酵饲料饲养黑水虻幼虫也仅需18d进入预蛹,而在相同条件下,含水量50%发酵饲料中饲养幼虫从卵孵化至进入预蛹需要23d,说明含水量降低导致由卵到预蛹的发育时间显著延长。May(1961)还研究了黑水虻在室内恒温条件下的蛹期,认为蛹期大约需要9~10d,在新西兰3月的室温下需要15~17d,在产卵后50d见到第1头成虫羽化。本研究没有记录蛹期,因此很难判断不同处理的幼虫期差异,但在本研究的条件下,50%含水量饲料饲养黑水虻从产卵到第1头成虫羽化的时间为43d,70%含水量饲料饲养黑水虻从产卵到第1头成虫羽化的时间为38d,亦说明低含水量可显著延长发育历期。这些发育历期的研究数据对于缩短黑水虻繁殖周期具有参考意义。由于成虫羽化后在适当的条件和种群密度时即可交配,交配后在室温下3d即可收到卵块用于下一轮养殖。因此,在生产实践中可以参考这些数据来指导和推算合理的养殖周期,以减少养殖成本。利用黑水虻集约化处理畜禽粪便还需要开展更多的研究,比如不同物料及不同饲养条件下的发育历期、转化效率、投入产出等等。本研究结果显示,合适的物料含水量不仅能够缩短处理时间,还可提高昆虫产量,使系统更加高效运转,本文还探索了不同含水量饲养条件下,预蛹过程与时间函数关系及羽化过程与时间的函数关系,这些数学模型的研究对具体生产实践具有重大的指导意义。可以通过这些模型控制和优化生产过程,增加产入,节约成本。本研究仅探索了低含水量饲料饲养条件下的幼虫、预蛹和羽化参数,对高于70%含水量饲料饲养条件下的参数未进行研究,但生产实践中的一些有机废弃物料如新鲜的牛粪或猪粪的含水量往往较高,甚至高于70%。因此,高于70%含水量饲料对黑水虻养殖参数的影响还需进一步研究。y=-3E-05x5+0