quechers方法提取蔬菜中有机磷农药的有效性及基质效应评估

quechers方法提取蔬菜中有机磷农药的有效性及基质效应评估

由于其光谱清晰、高效、降压快等特点，有机磷农药已成为世界上最常见的农药之一。其主要作用机制是抑制乙酰胆碱酯酶的活性，并具有神经毒性。还有导致突变和致死于等毒性药物。世界各国均制定了食品中有机磷农药残留限量法规;对于未制定最大残留限量的农业化学品及未注册的农药,日本及欧盟所设定的最大残留限量为10μg/kg或更低。蔬菜中有机磷农药的多残留测定方法有气相色谱法(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)、气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[3,7,10,11,12,13,14,15]。有机磷农药品种多,各个农药的物理化学性质差别很大,一些化合物的相对分子质量小、极性强、热稳定性差,不宜采用GC分析。Mol等采用LC-MS/MS测定果蔬中6种不适于GC分析的有机磷农药,文献[3,7,11-13]采用LC-MS/MS测定果蔬中各类农药多残留,其中包含的有机磷农药最多为22种。GB/T20769-2008虽包含所有有机磷农药,但有13种只能定性而未能定量,有20种检出限高于10μg/kg。叶瑞洪等采用LC-MS/MS测定果蔬及其他基质中61种有机磷农药多残留,需2次进样分析,增加了仪器分析时间及仪器污染。果蔬中农药多残留检测样品前处理的传统方法为乙腈提取、NaCl盐析分层、固相萃取小柱净化。QuEChERS样品前处理方法于2003年由Anastassiades等提出,与传统方法不同的是,采用MgSO4盐析分层和分散固相萃取(DSPE)净化;2005年该方法又进行了修改,针对一些酸碱敏感农药,引入了乙酸缓冲盐提取体系,该修改后的方法于2007年成为美国官方分析方法(AOAC2007.01);之后,欧盟又于2008年发布了其官方分析方法EN15662,该QuEChERS方法采用了较弱酸性的柠檬酸缓冲盐为提取体系。基质效应是LC-MS/MS多残留分析可靠定量的最大难题,又称为LC-MS/MS定量方法的“Achillesheel”,减小样品的基质效应对获得准确的回收率至关重要。对基质效应进行评估,可指导方法改进并采取有效的基质效应补偿措施,但目前评估基质效应的文献较少,仅查阅到两篇(文献)。本文比较了两种QuEChERS样品前处理方法提取蔬菜中66种有机磷农药的有效性,即未加入缓冲盐的原创QuEChERS方法及加入乙酸盐缓冲液的AOAC2007.01方法;考察了乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)及C18吸附剂对66种有机磷农药的吸附作用;以提取后添加法考察了青花菜、番茄、枝豆、萝卜、大葱基质中各目标物LC-MS/MS分析的基质效应。通过优化LC-MS/MS分析参数以提高灵敏度,应用仪器工作软件以按时间表的多反应监测(ScheduledMRM)采集模式,一次进样即可完成66种化合物的定性定量分析。1实验部分1.1农药标准品及标准溶液API4000四极杆串联质谱仪(美国AB公司),1200series液相色谱仪(美国Agilent公司);T25高速分散机(德国IKA公司);Milli-Q高纯水发生器(美国Millipore公司);BR4i高速冷冻离心机(法国Thermo公司)。PSA及C18吸附剂:40μm(美国Varian公司)。无水硫酸镁、无水硫酸钠、氯化钠、无水醋酸钠为优级纯(上海国药集团)。甲醇、乙腈为色谱纯(Merck),甲酸为色谱纯(Fluka)。实验用水均为高纯水(经Milli-Q超纯水器纯化)。17种农药标准品(特丁硫磷、敌百虫、砜吸磷、磺吸磷、硫环磷、甲基立枯磷、恶唑磷、苯硫磷、伐灭磷、氯唑磷、壤虫磷、甲基谷硫磷、乙基谷硫磷、灭蚜磷、丙硫磷、毒虫畏、吡菌磷)购自德国DR公司(纯度≥96%),分别以甲醇配制质量浓度为100~200mg/L的各个农药标准溶液;其余49种有机磷农药标准物质购自农业部环境保护科研监测所(质量浓度为100mg/L)。以甲醇配制1.0mg/L的66种有机磷农药混合标准溶液,于-18℃储存。基质匹配标准溶液:移取5份各0.5mL空白样品提取液于2mL进样瓶中,以弱氮气(N2)流吹干,分别加入40μg/L的66种农药混合标准溶液50、125、250、375、500μL于进样瓶中,各补加甲醇至500μL,再各加0.1%(v/v)甲酸水溶液500μL,配制成2.0、5.0、10、15、20μg/L相应的基质匹配标准溶液。基质匹配标准溶液现配现用。1.2样品前处理方法1.2.1lc-ms/ms分析称取10.00g均质试样于50mL具塞离心管中,加入20.0mL乙腈、4.0g无水MgSO4、1.0gNaCl,高速均质1min,以8000r/min离心5min,取上层溶液5mL于预先加有250mgPSA及750mg无水MgSO4的离心管中(对于含油蔬菜如荷兰豆、枝豆,再加入250mgC18固相吸附剂),涡旋30s,以8000r/min离心5min,上层溶液经0.22μm微孔膜过滤,取0.5mL滤液至进样瓶中,弱N2气流吹干,加入0.5mL甲醇及0.5mL0.1%甲酸水溶液溶解供LC-MS/MS分析。1.2.2无水mgso4,1.0gnacl将1.2.1节“加入20.0mL乙腈、4.0g无水MgSO4、1.0gNaCl”改为“加入20.0mL1%乙酸-乙腈、4.0g无水MgSO4、1.0g无水醋酸钠”,其余与1.2.1节一致。1.3电喷雾扫描scheduldmmWatersAtlantisue4d2T3色谱柱(150mm×2.1mm,3μm);柱温30℃;进样体积10μL。流动相:0.1%甲酸水溶液(A相)和0.1%甲酸甲醇(B相);梯度洗脱程序:0~3min,40%B;3~23min,40%B~95%B;23~25min,95%B→100%B;25~35min,100%B;35~36min,100%B~40%B;36~46min,40%B。流速为0.2mL/min。质谱条件:电喷雾离子化,正离子模式;电喷雾电压:5500V;雾化气流速55mL/min,辅助气流速55mL/min,气帘气流速20mL/min;离子源温度500℃;扫描方式:ScheduledMRM。其他条件见表1。2结果与讨论2.1分析方法的建立以流动注射方式在电喷雾离子源正离子电离(ESI+)模式下对66种有机磷农药的单一标准溶液进行母离子全扫描,再对其子离子全扫描,每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对进行MRM参数优化,优化的质谱参数见表1。对乙拌磷进行母离子全扫描时发现,乙拌磷在离子源中转化为乙拌磷亚砜,因此检测乙拌磷时以乙拌磷亚砜准分子离子为母离子。三唑磷与氯唑磷的相对分子质量相同,保留时间亦一致,相互间易产生干扰,2个化合物中仅氯唑磷含有氯原子,因此氯唑磷采用氯的同位素离子对作为定量、定性离子对,与三唑磷进行区分。API4000MS/MS的Analyst1.5分析软件具有“ScheduledMRM”功能,数据采集按照化合物的保留时间表进行,在软件中通过设定合适的MRM窗口宽度及化合物的保留时间,仪器自动计算数据点间隔时间,既可确保1次进样分析132对离子对,又可确保每个色谱峰有足够的采集数据点(每个色谱峰至少15点以上),保证了色谱峰的良好峰形及重现性,提高了灵敏度。分别以乙腈-水、甲醇-水作流动相考察了66个化合物的分离度、峰形及响应值,发现甲醇-水流动相明显优于乙腈-水流动相。实验发现加入甲酸可提高目标物的响应值,加入乙酸铵则响应值降低,因此确定以0.1%甲酸甲醇溶液和0.1%甲酸水溶液为流动相。图1为按1.2.2节进行前处理的番茄基质匹配混合标准溶液的提取离子色谱图。2.2种农药混合标准溶液对二溴磷的吸附QuEChERS方法采用分散固相萃取(DSPE)净化,固相吸附剂直接加入经盐析分层的样品提取液以吸附基质干扰物,因此吸附剂对目标化合物的吸附会导致回收率降低,影响测定结果的准确性。为考察PSA及C18吸附剂对66种有机磷农药的吸附作用,分别对以乙腈、1%乙酸-乙腈为介质的10μg/L的66种农药混合标准溶液按照本文方法加入PSA或PSA+C18进行DSPE净化后测定其浓度变化,结果发现2种介质标准溶液中二溴磷浓度均下降了30%(加入PSA)、50%(加入PSA+C18),提示PSA、C18能吸附二溴磷。进一步考察了66种农药在DSPE净化体系中的稳定性,以乙腈为介质的10μg/L的66种农药混合标准溶液分别加入PSA或PSA+C18吸附剂12h后,甲胺磷、氧乐果、内吸磷砜、甲基毒死蜱、杀虫畏、丙溴磷的浓度均下降了50%,敌敌畏及灭蚜磷浓度下降了90%,敌百虫和二溴磷未检出。而以1%乙酸-乙腈为介质的10μg/L的66种农药混合标准溶液分别加入PSA或PSA+C18吸附剂12h后,除二溴磷外其他化合物的浓度基本不变,提示若样品采用乙腈提取,提取液经DSPE净化后须立即与固相吸附剂分离,否则在一定时间内目标化合物会被PSA及C18吸附导致测定结果偏低。2.3机磷样品的前处理原创QuEChERS方法对一些稳定性差的农药回收率低,其结果与基质的pH值有关。加入乙酸盐缓冲液的QuEChERS方法,无论何种水果或蔬菜基质,样品提取液均处于pH为5的平衡缓冲状态,对于一些酸碱敏感的农药可获得高回收率。为考察两种QuEChERS样品前处理方法对66种有机磷农药的提取净化效率,本文以含水量高的番茄为基质,在3个添加水平(10、40、80μg/kg)下的番茄样品分别采用两种QuEChERS方法进行前处理,原创QuEChERS方法测定得到敌敌畏的回收率小于10%,甲胺磷、乙酰甲胺磷、甲拌磷、灭线磷、治螟磷的回收率为42%~60%,相对标准偏差(RSD)为15%~44%,这6种农药的回收率及精密度结果劣于AOAC2007.01方法;但该法对二嗪磷(碱敏感)的回收率优于AOAC2007.01方法(见图2);其余农药采用两种前处理方法的测定结果基本一致。二溴磷不宜使用DSPE净化,两种前处理方法的回收率均小于10%。由此可见,分析蔬菜中有机磷农药的残留量,AOAC2007.01方法优于原创QuEChERS方法,对于存在问题的二溴磷,当测定结果为阳性时,采用1%乙酸-乙腈提取,不加入NaAc(加入NaAc可能促进二溴磷分解),以MgSO4或NaCl盐析分层后直接稀释进样分析,可得到满意结果。2.4基质效应及基质效应检测基质效应是指样品分析液中除分析物以外的共流出组分改变了分析物的响应值,从而影响定量分析的准确度和重现性,其机制目前尚未完全清楚,一般认为是分析物的共流出组分影响了电喷雾接口的离子化效率所致。本文通过测定目标物在纯溶剂中的平均响应值(A,n=3)、在以1.2.2节进行前处理获得的基质匹配标准溶液的平均响应值(B,n=3),得到基质效应(MatrixEffect,ME)=B/A×100%。图3为青花菜、番茄、枝豆、萝卜、大葱基质中66种化合物在10μg/L水平的基质效应,大于100%表示基质增强效应,小于100%表示基质抑制效应。从图3中可知,萝卜、番茄基质中各有18个化合物的ME超过(100±15)%,枝豆基质中有40个化合物的ME超过(100±15)%,青花菜及大葱的基质效应最大,各有53及51个化合物的ME超过(100±15)%。青花菜含水分较低并含有较多的叶绿素,大葱含有较多的硫化物,2种样品的提取液均含较多的基质干扰物。图3中显示同一化合物在不同的基质中其基质效应不一样,不同化合物在同一基质中也各有不同的基质效应,因此在LC-MS/MS多残留分析中采用基质匹配标准溶液外标法进行校准定量能较好地补偿基质效应。2.5种基质匹配标准溶液的回归方程对质量浓度为2.0,5.0,10,15,20μg/L的66种有机磷农药的纯溶剂标准溶液及按1.2.2节进行样品前处理、按1.1节配制的青花菜、番茄、枝豆、萝卜、大葱5种基质匹配标准溶液按1.3节进行分析,以峰面积(y)对质量浓度(x,μg/L)做回归曲线,得回归方程y=a+bx,66种有机磷农药的纯溶剂标准溶液回归曲线的相关系数(r)为0.9960~0.9998,5种基质匹配标准溶液的r值为0.9950~0.9999。基质效应改变了回归方程的斜率及截距,通过对5种基质匹配标准溶液及纯溶剂标准溶液的回归曲线进行分析,发现同一化合物在同一基质不同浓度水平的抑制或增强效应并不一致,表现为拟合回归曲线并不是平行的,浓度越高其基质增强或抑制的程度越大。2.6回收率、rsd本文采用基质匹配标准溶液-外标法定量,应用AOAC2007.01样品前处理方法(1.2.2节)在青花菜、番茄、枝豆、萝卜、大葱5种空白基质中添加66种有机磷农药进行回收率试验,添加水平为10、40、80μg/kg,每个添加水平重复测定5次,除二溴磷外65种农药的回收率(Rec)为55%~122%,RSD为1.6%~18%。表2为番茄基质3个添加水平的平均回收率及RSD。以添加样品信噪比(S/N)≥3时的空白样品中的添加浓度确定方法的检出限(LOD),其范围为0.03~2.6μg/kg;以S/N≥10确定方法的定量限(LOQ),其范围为0.1~8μg/kg(见表2),所有农药的定量限均小于10μg/kg,符合国内外法规残留限量要求。3基质和农药的种类由于农药结构及物化