水果和蔬菜中维生素c的测定

水果和蔬菜中维生素c的测定

维生素是维持人体正常生理代谢所必需的有机化合物。它们中的大部分在人体内不能合成或合成量不足,必须从食物中摄取。维生素C就是其中的一种。水果和蔬菜是人类维生素C的主要来源。由于它较易被空气中的氧所氧化,易受温度、pH、酶、铜和铁离子、紫外线以及糖、盐等影响,因此,了解果蔬鲜度、成熟度、栽培品种、收获时间、储藏期,了解维生素C在果蔬贮存、加工中的变化关系到产品食用品质和人民健康,是果蔬主要的品质指标,其定量分析在水果蔬菜营养分析中占据重要位置。了解维生素C测定的原理和方法对在实际工作中选择合适的分析方法具有重要的指导意义。1还原型抗坏血酸维生素C又称抗坏血酸(还原型,AsA),是己糖的衍生物。一般认为,在生物体中,抗坏血酸是经以下两个途径合成的:D-葡萄糖→D-葡萄糖醛酸↘L-抗坏血酸ID-半乳糖→D-半乳糖醛酸↗在自然界中,没有D-抗坏血酸;后者可通过合成途径得到。抗坏血酸在合适的条件下,可氧化成脱氢抗坏血酸(也称氧化型抗坏血酸,DAsA),但这种变化是可逆的,即脱氢抗坏血酸也可还原为抗坏血酸;脱氢抗坏血酸可进一步被氧化,生成二酮古洛糖酸,但这一过程是不可逆的。还原型抗坏血酸←→氧化型抗坏血酸—→二酮古洛糖酸II在许多水果和蔬菜中,维生素C主要以还原型抗坏血酸存在的,而氧化型抗坏血酸含量较低;在花椰菜和秋葵中后者能占全部抗坏血酸的50%。2生物活性的指标根据测定目的和要求的不同,维生素C的测定可分为还原型抗坏血酸和总抗坏血酸两种情况,后者包括还原型抗坏血酸,氧化型抗坏血酸和二酮古洛糖酸(DKG)的总和。后者无生物活性。水果和蔬菜中AsA+DAsA占新鲜植物体内维生素C总量的90%以上。3维生素c在水果中的测量原理和特点3.1抗原酸还原剂的测定3.1.1asa含量的测定其原理是利用2,6-二氯酚靛酚钠盐(C12H6O2NCl2Na)在酸性条件下将还原型抗坏血酸氧化成氧化型抗坏血酸,而其本身被还原成无色的衍生物;当还原型抗坏血酸全部被氧化时,过量的2,6-二氯靛酚钠盐呈现红色,指示终点。该方法适于测定无色和浅色样液或提取液中的AsA,无须特殊仪器,操作简便、快速、准确。由于大多数果蔬和其制品有颜色,影响了终点的准确性。使用白陶土脱色和加1,2-二氯乙烷均不能得到理想的结果。作为对该法的改进,向一定量的AsA提取液中加入过量2,6-D,与AsA作用后,剩余的2,6-D被二甲苯萃取、比色。样液中AsA含量与二甲苯萃取液中浅红色呈线性负相关。因花青素不溶于二甲苯,故可测定深色样品。应用流动注射分析(FlowInjectionAnalysis,简称FIA),使该法的分析速度更快(120样品/h)、灵敏(检出限0.5ug/ml)。由于2,6-二氯靛酚和还原型抗坏血酸具有不同的电位(2,6-二氯靛酚的氧化还原电位是150mV,AsA的氧化还原电位是100mV),利用铂和氯化银复合电极测定其电位差的变化,可准确地测定样液中AsA的含量。该法适宜色泽较深样品中AsA的测定。溶解氧测定是利用极谱分析法原理进行的,其基本电路与电位滴定相似。但样品中同时存在的Fe2+、Sn2+、SO2、SO3、S2O32-等还原性杂质对本法则有干扰。扣除样品中内源还原性物质是对2,6-二氯靛酚法的一个改进。3.1.2残余碘的存在时其原理是基于AsA还原碘,自身氧化DAsA,而碘可由碘酸钾还原碘化钾来得到,当多余碘存在时,淀粉呈蓝色,指示终点。反应式如下:KI+KIO3+6H+→2K++3H2O+I2III还原型抗坏血酸+I2+2H+→氧化型抗坏血酸+2HIIV该法简便,但在测定深色样品时,准确度欠佳。3.1.3dasa的化学计量其原理是三价铁离子被AsA还原二价铁离子,后者与4,7-二苯基-1,10-菲咯啉(Bathophenanthroline,BP)生成红色络合物,其强度与样品中AsA含量有化学计量关系。该法具有快速,灵敏的优点;此外,样品中DAsA还可被Dithiothreitol(DTT)还原为AsA,同时测定DAsA的含量。采用流动注射分析停留技术还可实现AsA与果蔬常用抗褐变剂L-半胱氨酸的同时测定。3.1.4feiii-二氮杂菲络合物的稳定性测定是在pH=5.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中,抗坏血酸与铁(III)和1,10-二氮杂菲溶液相互作用,形成橘红色的Fe(II)-二氮杂菲络合物,在波长510nm处,吸光度与50ml抗坏血酸含量在10~200ug浓度内呈线性关系。该法的特点是简便快速,灵敏度高,干扰少。3.1.5cu2+催化剂氧化法其原理是还原型维生素C(AsA)在紫外区243.8nm处有最大吸收峰,以Cu2+作催化剂,利用溶解氧,将在243.8nm处有最大吸收的AsA选择性氧化为243.8inm处无最大吸收峰的DAsA,进行本底校正,此法具有简便、快速、准确的特点。3.1.6浊度与asa含量的关系其原理是在酸性提取液中的AsA,可被亚硒酸氧化成DAsA,后者还原成元素硒,在一定条件下,其溶液中形成稳定的悬浊液。当20~50ml浸出液中AsA含量在0~4mg时,浊度与AsA含量成正比。样品中含有单宁、山梨酸、还原酮类不干扰测定。Fe2+、SO2在常温下干扰不明显,仅亚锡离子有干扰。3.1.7高效液相色谱法hplc此法的优点不仅操作简便,分离时间短,对结构不稳定的维生素C,尤为适合;缺点是所用仪器较为昂贵。3.1.8抗坏血酸含量其原理是用溴水将AsA氧化成DAsA,而后者与邻苯二胺缩合,可用于极谱定量测定抗坏血酸含量。脱氢型的还原糖、还原酸等对测定有干扰,可用氯仿萃取分离干扰物质后进行测定。3.2维生素c总量的测量3.2.1,3-二酮-5-甲基苯磺酸法此法为测定维生素C总量最常用的方法。其原理是用活性炭把AsA氧化成DAsA,在pH5以上时,后者分子重排,其内酯环裂开生成2,3-二酮古乐糖酸(DKG),与硝基苯肼偶联,生成红色的脎,其呈色强度与DKG浓度成正比;如果再测定出DKG、DKG+DAsA的含量,则可计算出AsA、DAsA的含量。该法虽然测试过程长、须严格掌握测试条件,但其准确度和精密度均较高。3.2.2荧光强度测定其测定维生素C的基本原理是:样品中的AsA被氧化成DAsA,并与邻苯二胺反应,生成荧光物质喹喔啉(Quinoxaline)衍生物,荧光强度与DAsA的浓度成正比,用荧光计测定荧光强度。该法具有较强的专一性,样品中有些成分会造成干扰,可作空白试验校正干扰物质所产生的荧光。此法的优点是,生成荧光物质所需时间短,操作简单,能在短时间内测定维生素C总量和分开测定AsA、DAsA的含量。3.2.3比色法终点果蔬中的维生素C,在过氧化氢存在下,添加合成底物1,4-二氨基苯,通过过氧化物酶氧化显色,作为维生素C氧化终点,然后比色测定。该法的特点是不需要昂贵的仪器,适应性强,容易掌握,费用低,检测快速,不需要预先纯化所分析的试样。在上述测定维生素C的方法中,有些既可以测定AsA,或DAsA,又可测定维生素C总量,如分光光度法、紫外光度法、2,4-二硝基苯肼法、荧光分光光度计法、过氧化物酶法,在同时测定AsA和DAsA时