冷冻电子断层成像的研究现状与发展趋势

冷冻电子断层成像的研究现状与发展趋势

0膜蛋白结构解析冷冻电视法和三维重建技术在结构生物学领域的应用迅速，已取得重要进展。与X-射线晶体学和核磁共振波谱学(NMR)等传统的测定蛋白质分子三维结构的方法相比较,它具有以下几个方面的优势:1)保持生物样品的活性和功能状态;2)无须制备晶体,特别适合难于结晶的大分子及其复合物的三维结构判定;3)结合新型的电子显微镜、制样机器人等设备和技术,可以实现显微制样、数据收集、三维重构全过程的自动化或半自动化,为高通量、快速解析大分子及其复合物的三维结构打下基础。利用冷冻电镜技术进行三维重构的主要方法有:单颗粒分析(singleparticleanalysisSPA)方法,电子晶体学(electroncrystallography)方法,和电子断层成像(electrontomography,ET)方法。其中电子晶体学方法较多用于一些膜蛋白结构的解析,其解析的结构可以达到很高的分辨率,但要得到蛋白的二维晶体仍然是一个非常具有挑战性的工作。单颗粒分析方法适用于具有结构同一性的样品,通过采集大量单个颗粒的二维投影图来重构三维结构,是冷冻电镜三维重构发展最快也是最主要的结构解析方法。利用单颗粒电镜重构技术已经解析出了很多生物大分子、病毒以及复合物的结构,目前的最新研究成果已经可以在准原子或原子分辨率下解析具有高度对称性的病毒分子结构,最高精度已经达到约3.3魡左右。在准原子分辨率下,许多结构上的细节都清晰呈现,并使得建立基于冷冻电镜密度图的独立原子模型(denovomodelling)成为可能。对于不具有对称性的大分子复合体,其结构解析的分辨率也在迅速提高。另外,利用单颗粒分析方法解析各种重要功能的分子机器(molecularmachine)在不同功能状态下的结构,以及利用其进行重建结果的多变量统计分析以确定生物大分子复合物不同的构象与结构异性也是目前研究的热点。电子断层成像通过获取同一区域多个角度的投影图来反向重构所研究对象的三维结构,适合于在纳米级尺度上研究不具有结构均一性的蛋白、病毒、细胞器以及它们之间组成的复合体的三维结构。与蛋白质电子晶体学和单颗粒技术相比,这种技术无需样品颗粒具有结构同一性,也不强调样品具有一定的对称性。因此,虽然目前电子断层成像所获得的结构的分辨率(约4~10纳米)不能与以上两种技术相比,但其在研究非定形、不对称和不具全同性的生物样品的三维结构和功能中有着不可替代的重要作用。冷冻电子断层成像的适用尺度非常广泛,包括从分子水平的蛋白质,到亚细胞水平的细胞器,以至细胞水平的组织结构。它有效地填补了X-射线晶体学、核磁共振以及冷冻电镜单颗粒分析等方法得到的高精度结构和光学显微镜技术得到的低分辨率的细胞整体图像之间的空白。同时,利用冷冻电子断层成像法在获得体外或细胞环境下大复合体或分子机器的纳米精度的三维结构后,嵌入组成这些大复合体或分子机器的各亚单元的通过X-射线晶体学、NMR或单颗粒分析等方法得到的原子分辨率结构,可以得到生理环境下重要分子机器在细胞环境中的三维空间分布以及组装,从而为深入理解这些分子机器的相互作用机理提供重要而有益的信息。因此,电子断层成像技术近年来在冷冻电镜研究领域得到越来越多的关注,也被2002年《科学》杂志评为当年的十大科技突破之一。1ct成像结合成像转色法重构三维结构的图像,根据样品的结构直接进入三维断层扫描技术(tomography)是从一个物体的投影图像重构获得物体内部结构的技术,通过获取同一物体的多个连续角度下的二维投影图来反向重构它的三维结构。与医院中使用的CT扫描类似,简单地说,电子断层扫描技术就是将一个物体(样品)沿着一个与电子束垂直的轴旋转,每旋转一个角度,采集这个物体在相对应方向上的二维投影像,通过对这些二维投影图的处理(相互配准),将不同角度的二维投影图反向重构(如加权背投影等方法),获得样品整体三维结构的技术(图1)。和CT成像转动光源获得不同角度的投影图不同的是,ET的光源(电子束)不转动,通过倾转电子显微镜的样品台来得到所研究样品的不同方向的投影。依据电镜型号和样品杆的不同,样品倾转范围大概在±60~±80度之间。利用多角度投影的方法重构物体的三维构象的断层扫描技术的理论基础在几十年前已经建立。但早期的数据收集依靠人工完成,且需要处理的数据量相对于当时的计算机处理能力而言也很庞大,因此相关工作的进展较少。近年来,随着计算机硬件的高速发展和数据处理能力的大大增强,特别是电子显微镜的更新换代以及断层成像数据的自动收集硬件和软件方面的改良,使得电子断层成像研究,尤其是冷冻电子断层成像研究,取得了极大的发展,也正在成为冷冻电镜研究中一个越来越活跃的研究领域。1.1样品制备1.1.1电子束的物理性质和表面形貌,都可以采用化学方法进行制样和进行样品由于电子断层成像较适合用于研究细胞环境下的三维结构,因此,很多的电子断层成像的工作采用固定、包埋和切片的常规方法制备电镜样品。与CT扫描使用的X-射线相比,电子束能穿透的样品厚度较小,限制了电子断层扫描技术对大的生物样品(如完整的真核细胞等)的研究。对电子束难以穿透的厚样品,如细胞等,只能采用切片的方法进行制样。常规的制样方法包括化学固定、树脂包埋、切片和染色等步骤。为了研究整个细胞、组织等样品,一般使用1%~5%戊二醛作为主固定剂,利用四氧化锇等作进一步固定后,在一系列梯度浓度的乙醇和丙酮中进行脱水以减小迅速脱水引起的结构变化。脱水后的样品被转移到树脂中在60度左右进行树脂的聚合包埋,然后进行系列切片(电子断层成像样品一般做成100~500nm厚度的切片),最后利用鞣酸和醋酸铀等进行染色,送入电镜观察和照相。1.1.2冷冻电子断层成像对于一些电子束能穿透的较小或较薄的样品,如病毒、细菌,以及一些小细胞等,可以采用与单颗粒分析制样方法相同的快速冷冻(plunge-freezing)的方法准备样品并进行冷冻电子断层成像研究。冷冻电子断层成像的主要优势是样品接近于天然状态,克服了由于化学固定、脱水、冷冻替代和染色等带来的可能的假象,很好地保护了生物样品结构的完整性。快速冷冻制样法将保持在自然状态缓冲液中的样品加入覆盖在电镜铜网上的带孔碳膜上,用滤纸吸去多余样品,然后将样品快速浸入处于液氮温度环境的液态乙烷冷冻剂中。由于样品层非常薄,冷却速度很快(可达几万度/秒),样品中的水会形成一种非晶态的冰,样品分子即悬浮在这层玻璃态的冰中,保留了样品的原始结构信息及构象状态,并在利用液氮保持低温的条件下送入冷冻电镜观察。1.1.3不同冷冻方式制备的样品由于水是热的不良导体,对于大的样品(如整个细胞),冷冻能达到的深度和体积是非常有限的。虽然常规的通过化学固定、树脂包埋、切片、染色等步骤进行制样的方法对细胞和组织器官等的电子断层成像也取得了许多很好的成果,但是制样过程仍然会引起一些结构畸变,影响了样品的结构细节。对厚样品可以采用高压冷冻(highpressurefreezing,利用高压降低水的冰点使得冷冻达到更深的层次),随后进行冷冻替代(freezesubstitute,在低温下用有机溶剂将冷冻组织进行置换脱水),逐渐升温后进行传统的包埋、切片等步骤进行制样。利用这种方法制备的样品在结构细节的保持上可以取得较好的效果。而真正能使大细胞和组织保持天然状态的制样办法是高压冷冻并进行冷冻切片(cryo-sectioning)。但冷冻切片还是一项很具挑战性的工作,目前只有少数的实验室能够达到较高的成功率。1.2电子故障图像的三维重建过程1.2.1数据采集系统电子断层成像的数据收集从找到合适的成像区域开始。在起始位置成像后,样品倾转到下一个角度,对同一区域进行成像。电子断层成像的数据收集的大概过程如下:1)寻找(search)合适区域,一般在较低放大倍数下进行;2)调节样品台倾转中心高度(eucentricity),使样品台倾转时样品维持在成像中心范围;3)调焦(focus);4)找到同一成像区域的精确跟踪(tracking);5)照相(exposure);6)样品倾斜到一个更高角度后,重新找到样品的位置中心,然后重复以上四个模式,即search、focus、tracking、exposure几个模式交替进行。由于电子断层方法需要对同一个区域反复成像,对样品局部区域可能造成较大幅度的辐照损伤,因此必须严格控制样品台的精确倾转,保持对成像区域的自动跟踪,以及控制每次成像的电子束剂量等。为了减少对成像区域的电子辐照损伤,一般利用lowdose模式的数据采集方案:即search模式采用较低的放大倍数,而focus和tracking模式时的照相区域稍微偏离样品中心exposure模式位置以减少对样品的辐照。在数据收集过程中,对不同倾转角度图像的tracking是通过互相关运算来完成的。为了提高图像衬度和跟踪的准确性,可以在样品中加入胶体金颗粒。样品倾转的角度范围取决于样品杆类型、铜网类型、感兴趣区域在铜网处的位置和样品的厚度。数据收集方式可以从0度角开始向两端倾转,也可以从最大负面倾斜角度开始到最大的正面倾斜角。最常见的是记录倾斜系列范围在±60~±70度之间,采用1~3度间隔的线性步长。为了提高缺失锥(missingwedge)附近的采样密度,可以增大高角度位置的采样密度,如采用Saxton方案等。目前已有一些相对成熟的自动数据采集系统,包括一些设备生产厂家提供的商业软件,如FEI的Xplore3D,Titzs的EM-Menu等,以及一些实验室开发的软件如:SerialEM,UCSFTomo,TOM,Leginon等。这些程序通过控制显微镜的光学系统,样品台和CCD来自动记录样品在不同角度下的一系列图像。随着电镜硬件以及软件控制的日趋完善,可以在预先设定的想要照相的各个区域进行断层成像数据的批量收集(BatchTomo),大大提高了数据采集效率,使得高通量、全自动化的电镜断层成像数据采集系统的成为可能。1.2.2基于标记点与互相关的图像配准电子断层成像三维重构要经过两个步骤,首先是不同角度的投影图像的配准,其次是配准后图像的反向投影进行tomogram的三维重建。对一个倾斜系列投影的图像进行配准是获得高质量重构的重要基础。图像配准主要是计算倾转过程中由于样品台等的移动使得图像中心的移动;其次,还需对由于不完美的成像条件导致的倾转角度,图像自身的旋转、扭曲以及放大倍数等进行修正。这种修正将显著提高三维重建的质量。图像配准有两种最常用的方法:即基于标记点的方法与基于图像互相关匹配的方法。基于标记点的方法是在样品制备过程中,掺入一定大小的胶体金作为标记物,然后根据胶体金在不同角度二维投影图中的位置对该角度投影图的区域中心和倾转轴取向进行优化,这种方法最常用的软件是IMOD。有时候,金颗粒在不同角度倾转图像中会发生漂移,导致不能很好地配准。如果不掺入胶体金作为标记物,可以利用互相关分析来进行不同角度的投影图的配准和优化,其中比较常用的软件有Protomo。除了IMOD和Protomo外,还有其他一些软件用于图像配准,如Spider、EM3D、XMIPP、TOM等以及FEI的Inspec3D等商业软件。1.2.3其他重建方法电子断层图像的三维重构是由所有配准的倾转投影图重新反向投影到一个3D体积中形成的。最常用的方法是加权背投影(weightedbackprojection,WBP),将每个二维投影图像背向其记录时的倾斜角方向投影到三维空间中,所有背投影图像在三维空间中叠加形成样品的三维结构。为了防止对低频信号的过采样,引入了一个权重滤波器进行调节。其他的重建方法包括70年代早期发表的迭代重构方法,如代数重建技术(algebraicreconstructiontechnique,ART)和联合迭代重建技术(simultaneousiterativereconstructiontechnique,SIRT)等。迭代重构方法基于一个前提:重构样品沿着投影角的反向投影应该与原图像一致。据此,通过此方法将原始投影图和重构的投影图进行循环比较和优化。迭代方法的一个优势是具有一致的权函数,但计算量很大,得到三维重构结果要花费很长时间,GPU和并行处理算法的采用对此有所帮助。1.2.4异压滤波一般来说,冷冻电子断层成像中各个二维投影图像的信噪比都比较低,因此重构产生的cryo-tomograms的噪音也很大。所以对重建结果要进行适当的降噪处理以突出研究对象。常用的去噪处理方式包括中值滤波、非线性滤波等。其中,各项异性扩散的非线性滤波方法用得比较多,如Tomoand等软件。为了进一步将对象从背景和噪声中区分开,要对重建结果进行分割(segmentation),以分开对象和背景。最简单的方法是使用手动分割,它需要用户绘制对象和背景的边界轮廓。分割完成后可以利用表面渲染技术(surfacerendering)对tomogram进行可视化。也有专门的软件帮助进行该过程,其中AMIRA软件包是用的最多的,其它的如IMOD包中也提供该功能。以下维基百科网站收集了很多以上提到的电子断层成像数据收集、处理以及其他冷冻电镜成像处理中会使用到的软件。(/wiki/Software_tools_for_molecular_microscopy)。2在细胞生物学和教学中的应用显微技术在细胞生物学的发展历史上起着极大的促进作用。荧光显微镜和共焦显微镜为细胞生物学的发展提供了有效的途径。近年来,绿色荧光蛋白家族以及超高分辨率的荧光显微镜,如PALM、STED等的发展为在细胞中定位一个特定蛋白或分子提供了非常强有力的工具,也为分子细胞生物学的发展提供了一个良好的工具。但这些光学成像工具仍然具有其局限性,比如只能一次定位少量蛋白的空间信息,空间分辨率也还有待提高。而电子断层扫描技术可以对细胞体内以及分离出来的细胞器进行三维重构,并提供了在纳米尺度范围内对细胞器环境下蛋白质及分子机器的结构进行重构的方法,对研究自然环境下各种分子机器的结构与功能的关系、它们在细胞中的空间布局,以及精细的细胞结构等具有重要意义。过去一些年间已经利用电子断层成像技术获得了对于细胞生物学来说非常有价值的信息,比如线粒体、内质网和高尔基体;核孔复合物在细胞环境下的三维结构信息等;细胞骨架在细胞中的三维分布;以及抗体在细胞中的传递等。对于一些小的不需切片的生物对象,可以用plunge-freezing方法获得样品以进行冷冻电子断层三维重构,这方面的研究有肌动蛋白、细菌和微管鞭毛等。病毒一直是冷冻电镜的重要研究对象之一。过去的二十多年,冷冻电镜单颗粒分析技术已经为病毒结构与功能研究提供了比较详尽的资料,尤其是那些具有二十面体对称性的病毒结构。与单颗粒技术相比,电子断层扫描技术的研究对象目前主要集中在不定形多态的、在生命过程中多变的并具有重要生物功能的病毒及其复合物,如疱疹病毒、艾滋病毒[18~22]等。虽然电子断层扫描技术所获得的分离的病毒粒子的结构没有单颗粒技术获得的分辨率高,但它能解析一些没有对称性、在病毒生物功能中起重要作用的病毒的结构,两种技术对病毒的结构与功能研究都起着非常重要的作用。3冷冻电子断层成像的硬件设备我国在电子显微学研究方面具备很好的基础和大量的积累,但高性能冷冻电子显微设备的缺乏对冷冻电子显微学的开展曾经产生了很大的制约。受益于近年来国家对冷冻电子显微学重要前景的重视和对科研投入的增多,目前国内已经拥有了包括2台TitanKrios、1台TecnaiF30等在内的高端冷冻电子显微镜研究设备,其中一些单位也建成了一流的包括Vitrobot、高压冷冻、冷冻切片等适合冷冻电子断层成像研究开展的设施。同时,多家研究机构也计划或正在购置更多的冷冻电镜设备。因此,中国已经具备了很好的契机来开展冷冻电子显微学和电子断层成像方面的工作。冷冻电子断层成像的快速发展是随着近年来电镜设备的改进,特别是可以自动控制样品台的倾斜并自动获得相应投影图像的软件系统而发展起来的。要进行cryo电子断层成像,电子显微镜需要满足一定的要求,加速电压一般要在200~400kV,最好装有场发射枪(FEG)。试样必须可以保持在低温条件下(-196℃)在显微镜下观察。同时,要有一个可倾转的样品台,电镜内集成的可倾转的冷冻样品台的稳定性和倾斜性能比外插式的cryo-holders要好。为了自动收集电子断层倾转系列图像,显微镜要配备一台CCD和相应的软件控制系统。电镜的光学系统和样品台的移动、样品台的倾转、样品中心成像区域的跟踪以及成像时的调焦等都可以由相应的软件系统控制。断层成像通常配备2k×2k或4k×4k的CCD相机,最好能配备一个能量过滤器,可以研究更厚的冷冻样品并过滤掉非线性弹性散射的电子提高成像质量。4e-tilt双轴倾转和双轴-n-ms的电子断层成像技术冷冻电子显微学和电子断层成像依然是一个年轻的学科,处于发展和完善阶段,无论在理论上还是实践上都有许多工作要做。随着设备的改进和应用的范围的扩大,冷冻电子断层成像的全自动、高通量数据收集以及高效三维重构也有更为迫切的需求。因此,探讨和发展新的样品制备、数据采集、图像处理和三维重构方法,将X-ray/NMR数据与电子断层数据整合、扩展数据范围、提高结构解析的分辨率,是电子断层成像领域要解决的技术问题。1)采用更好的样品制备方法(如高压冷冻、冷冻替代、冷冻切片等)保持细胞或细胞器等样品的结构细节;2)改进数据收集方法、硬件及软件,实现冷冻电子断层成像的自动化、高通量数据收集。如利用Double-tilt双轴倾转减小缺失锥(missingwedge)效应;利用Batch-tomo方法高通量收集电子断层成像数据;提高加速电压和采用能量