植物启动子的功能

植物启动子的功能

植物可以通过改变外部环境，跟踪特定基因的表达，适应复杂生长环境。真核生物的基因表达调控包括转录前调控、转录调控、转录后调控、翻译调控和翻译后调控。其中,转录水平的调控受顺式作用元件和转录因子协调作用,是表达调控的关键环节。植物基因启动子中包含多种重要的顺式作用元件,在转录水平上参与调控下游相应基因表达,从而使植物能够抵御外界环境胁迫。因此,对植物启动子的研究有助于了解基因转录调控表达模式及其调控机制,并应用于基因工程中提高或改进外源目的基因的表达。1预启明子与国物主义者植物启动子是一段能与RNA聚合酶及其转录因子特异结合、决定基因转录起始的DNA序列。植物基因的转录起始位点通常位于翻译起始密码子(ATG)上游-40~-70bp处,转录起始的保守序列为CTCATCA,中间的A为转录的起始点(编号为+1)。植物启动子由核心元件和上游元件构成,如TATA-box(Goldberg-Hogness框或Hogness框)和起始因子(initiator)。在逆境相关基因的启动子序列中还存在一些与逆境诱导相关,参与基因转录调控的顺式作用元件。目前研究较深入的有:脱落酸响应元件(ABA-responsiveelement,ABRE)、乙烯响应元件(ethylene-responsiveelement,ERE)、茉莉酸类物质应答元件(jasmonate-responsiveelement,JRE)、低温响应元件(low-tempraturereponsiveelement,LTRE)和干旱应答元件(dehydration-responsiveelement,DRE)等。ABA诱导表达基因启动子存在一个PyACGTGGC保守序列,该序列在小麦胚胎发生晚期表达基因E3中首次被确定为ABA应答元件,核心序列为A/GCGT。拟南芥RD29B基因启动子中存在两个ABRE,只有这两个元件相互作用,形成ABA应答复合体,才能指导核心启动子的ABA诱导活性。植物启动子按其转录方式可以分为:组成型、组织特异型和诱导型启动子,但不具有绝对性,如绝大部分果实特异性启动子也同时存在乙烯应答元件,也可以看做是乙烯诱导型启动子,所以不同的研究方法和分析角度会对同一启动子的分类产生差异;同样,一种类型的启动子也往往会具有其他类型启动子的特性。1.1中国植物基因外源基因组成型启动子调控的基因表达不受外界环境条件的影响,几乎在所有植物不同组织中都能表达。目前,植物转基因工程中使用的多是组成型启动子。典型的是烟草花叶病毒(cauliflowermosaicvirus,CaMV)35S启动子,被广泛应用于双子叶植物转基因工程。拟南芥色氨酸合成酶蛋白β亚基基因(tryptophansynthaseproteinbetasubunitgene,PTSB1)启动子和植物光敏色素B基因(phytochromeBgene,PPHYB)启动子是两个来源于植物的组成型启动子。在转基因烟草中PTSB1和PPHYB启动子的活性高于35S启动子。由此,在植物基因工程应用中,这两种植物启动子可替代35S启动子,以避免其可能存在的生物不安全性。再者,还有广泛应用于单子叶植物转基因工程研究的水稻Actin1和玉米Ubiquitin启动子,据报道,这些启动子在大麦和玉米中的表达效率是35S的15倍,而在双子叶植物中仅有微弱表达。尽管组成型启动子能高效、非特异地启动外源基因表达,但这种外源基因的组成型表达往往会造成资源的非必要浪费,同时大量异源蛋白的积累也会打破植物原有的代谢平衡,阻碍植物的正常生长。因此,能够驱动外源基因在植物组织器官中定时、定点表达的组织特异型启动子逐渐成为研究的重点。1.2花的特异性基因在组织特异型启动子的调控下,目的基因只在特定器官或组织中表达。该类启动子一般存在一些与组织特异性相关的特异基序。Nitz等从拟南芥中分离得到编码在根和下胚轴中特异表达的黑芥子酶基因Pyk10启动子序列,该启动子能调控目的基因在转基因拟南芥根部高水平特异表达。番茄Rubisco小亚基的rbcS3A基因的5′上游调控区可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶中高效表达,且不受光诱导。Bate等通过缺失突变分析马铃薯花特异表达基因LAT25的启动子发现,调控花粉特异表达元件位于该基因启动子-492到-52区段。Yamagata等克隆了黄瓜素基因Cucumisin5′上游1.2kb启动子序列,该启动子具有果实特异性。郝彦玲等从向日葵(Helianthusannuus)中分离到Hads10G1基因上游的启动子片段,GUS活性检测表明,具有种子特异性。植物韧皮部负责植物体内糖等光合产物从叶到其他组织的运输而成为许多植物病虫害的侵害目标。因此,韧皮部特异启动子的研究对于抗病、抗虫植物基因工程的研究有重要的意义。Guo等分离了南瓜(Cucurbitamoschata)PP2基因启动子序列NP,缺失分析发现,转录起始位点上游-465到+8的437bp启动子片段NPⅡ具有和全长启动子NP几乎相同的活性,且同样能够指导目的基因在韧皮部特异表达。还有一些来源于病毒的韧皮部特异表达启动子,如水稻RTBV启动子,Bhattacharyyai等将水稻RTBV(ricetungrobacilliformvirus)基因转录起始位点上游序列与GUS基因融合,转基因实验确定该片段具有启动子活性,且仅在转基因水稻叶片微管组织的韧皮部表达。1.3快速诱导的转录基因表达由于信号刺激而具有转录活性的启动子称为诱导型启动子。该类启动子可以快速有效地诱导转录基因的“开、关”:可根据需要在植物特定发育阶段、组织器官或生长环境下接受诱导信号,诱导基因表达;也可以随时解除胁迫,停止表达。1.3.1诱导型启动子非生物胁迫,如干旱、高盐、低温和高温等,可以诱导植物体内相关基因表达,其转录调节的主要机制之一是逆境胁迫有关的转录因子(调节蛋白)与基因上游启动子中关键顺式元件特异结合,增强启动子的活性,提高目的基因的表达量。rd29A启动子能够驱动目的基因在干旱、低温和ABA等非生物胁迫下表达,是目前抗逆植物基因工程中应用最广泛的诱导型启动子。Kasuga等分别利用35S启动子和胁迫诱导型启动子rd29A驱动拟南芥DREB1A转化拟南芥,rd29A::DREB1A转基因植株的胁迫耐性明显高于35S::DREB1A的转基因植株;而且在胁迫诱导下,rd29A驱动的目标基因表达积累与胁迫诱导相关基因的表达在相同组织中,说明诱导型启动子能更有效地提高植物对低温、干旱和高盐的耐受性。冬麦blt101基因启动子受低温诱导,在其转录起始位点上游-168到-275区段内存在一个高度保守的TCA-like元件(TCATCTTCTT),Brown等首次发现该元件与诱导目的基因在低温胁迫下高效表达密切相关。Takumi等分离了一个小麦低温应答基因家族基因Wcor15上游2kb的启动子序列,分析显示,该区段内包含有4个CRT/DRE-like序列,包括CCGAC核心基序,实验证明该启动子受低温和光诱导。Park等克隆了大豆(Glycinemax)CAM亚型基因ScaM-4上游约2kb启动子片段,缺失分析表明,ScaM-4启动子的-858到-728bp分别存在一个盐胁迫响应顺式作用元件。1.3.2烟草导型启动子当植物受到真菌、细菌、病毒等病原微生物侵染时,植物体内相关保护蛋白基因被激活,从而消除有害代谢产物对植物自身的伤害,调控这类保护蛋白基因表达的启动子即生物胁迫诱导型启动子。Zheng等从杂交三倍体白杨基因组DNA中分离得到一个TIP特异启动子,序列分析发现,在该启动子区段包含多个与植物保卫基因激活有关的顺式调控元件如:GC富含区段、AT富含区段和W-box等;据此推测该TIP特异启动子可能是一个病原诱导启动子且是防御相关基因表达所必需的。彭建令等克隆了3个烟草病原物诱导性启动子PPP1、PPP2和PPP3,都含有细菌诱导元件;青枯菌接种第2代转基因植株组织化学染色发现,3个PPP启动子均受青枯菌诱导,且其活性是35S启动子的数十倍。1.3.3丁质酶基因vch3外源激素可以诱导植物产生一系列信号,激活相关转录因子表达,从而调控植物相关基因的转录。Li等从山葡萄(VitisamurensisRubr.)叶片中分离了ClassⅢ几丁质酶基因VCH3的5′非编码区,该片段转录起始上游-1181bp和-293bp处存在两个SA应答顺式作用元件,受SA诱导。Wang等分离了烟草内源β-1,4-葡聚糖酶基因(cellulase)NtCel7上游1470bpDNA序列,将NtCel7启动子下游与GUS基因融合构建植物表达载体转化大豆、番茄和拟南芥发现,该启动子在异源植物内与生长素诱导有关而与赤霉素、蔗糖和乙烯诱导无关。水稻OsEBP-89基因启动子受多种激素诱导,Li等研究发现包含一个G-box的-1200到-800区段是茉莉酸甲酯诱导的关键序列。2植物启动子的克隆法2.1测序及活性分析基因组文库筛选启动子是使用较早的一种克隆启动子的方法。首先构建适当丰度的基因组文库,然后用与待克隆启动子相关的已知序列片段或特异基因片段做探针与构建好的基因组文库杂交,筛选出含有目的启动子的克隆,测序及活性分析即可确定启动子序列。Rinehart等利用此方法克隆了纤维发育中后期特异表达基因FbL2A2.3kb的启动子序列。目前该方法由于需要构建文库及同位素标记探针,操作复杂而较少应用。2.2启动子基因活性检测构建含有报告基因的启动子缺失质粒载体筛选启动子是一种高效、快速分离启动子的方法。将用适当限制性内切酶酶切的DNA片段与启动子缺失质粒载体重组,然后把重组混合物转化寄主细胞,检测报告基因活性。若检测报告基因具有活性,则该插入重组DNA片段具有启动子活性。Rechael等最早利用该方法,以四环素抗性基因为报告基因构建了启动子探针质粒pbrh3B,并得到了一些原核和真核启动子片段;随后Fordor等利用大肠杆菌(E.coli)LacZ基因为报告基因,从酵母基因组中分离到PX启动子。尽管该方法能够用于随即筛选启动子,获得大量未知序列启动子片段,但不能特异分离某一特定基因的启动子片段而使其应用受到局限。2.3自致时的遗传资源启动子捕获(promotertrap)技术是近年来随着基因标记技术的发展而兴起的一项新的克隆启动子的方法,类似于利用报告基因筛选启动子。该技术将不含启动子的报告基因构建于载体上,插入到内源基因的外显子中,当插入位点与内源基因方向一致时,可以由该内源基因的启动子驱动报告基因表达。通过检测报告基因是否表达及表达的时空特异性,判断报告基因插入位点近旁是否存在基因的启动子及其表达特性,进而从报告基因的旁邻序列中分离出该启动子序列。王爱民等将无启动子的GUS基因构建在非自律的Ds转座子上,同时引入抗除草剂的Bar基因构建了Ac/Ds(GUS)结构的启动子捕获质粒p13B,用农杆菌介导的方法转化粳稻品种中花11的胚性愈伤组织,在T2植株中检测到37株Ds发生可遗传转座的植株。涂知明等利用一个无启动子并带有UidA基因的质粒pPLGUS捕获了一个株系的花药组织特异性启动子,并通过PCR的方法分离了该启动子。方华舟等同样利用pPLGU改造质粒通过基因枪转化水稻材料,通过连续3代的遗传分析证明至少3株水稻花粉组织特异启动子被捕获。2.4pcr技术启动键2.4.1不同灰树花基因dna-gf1和gpd-gf2的同源性比较对于已知基因序列,根据已经发表的基因序列设计引物,克隆基因的启动子。该方法多应用于已知序列启动子的深入功能研究。王海燕等根据已报道的香菇gpd启动子设计引物,从灰树花基因中扩增获得大小分别为1018bp和615bp的启动子片段pd-GF1和gpd-GF2,与香菇gpd启动子序列同源性分别为96%和98%。王景雪等以水稻基因组DNA为模板,16Kda醇溶蛋白启动子两端序列为特异引物,用PCR方法从水稻基因组DNA中分离了16Kda醇溶蛋白启动子片段,与已发表序列的同源性高达99.9%。2.4.2采用锅炉柄式pcr检测首先选择适当的限制性内切酶酶切基因组DNA,然后用T4DNA连接酶将酶切片段连接成环,以连接产物为模板进行PCR扩增启动子片段,包括反向PCR和锅柄式PCR。反向PCR技术(inverse-PCR,I-PCR)该技术将基因组DNA酶切后自连成环,以环状混合物为模板根据已知序列设计反向互补引物扩增两引物间未知序列片段。Digeon等用该方法分离了小麦种子特异表达基因puropndoline的1068bp的启动子片段,转基因检测发现,该启动子片段能驱动目的基因在水稻种子中特异表达。为避免酶切后DNA片段在自身环化过程中的随机性而导致I-PCR的非特异性扩增,Kim等采用I-PCR,设计了两对嵌套反向引物,克隆了芝麻种子特异表达基因SeFAD2的启动子序列。锅柄式PCR技术(panhandle-PCR,P-PCR)P-PCR由于以5′端已知序列和3′端反向重复序列互补配对形成的锅柄式环状单链为模板而大大增加了扩增的特异性。目前该方法多应用于人类基因组等长启动子的分离。2.4.3抗菌蛋白rtlp扩增接头PCR技术的原理为,首先设计一个长链接头和一个与之互补的短链接头,并在短链接头的3′端设计一个NH2序列,以阻止聚合酶催化的短链延伸。两条单链退火后形成的双链接头能在3′端形成一个酶切位点的粘性或平末端,然后选用能形成该酶切位点末端的限制性内切酶酶切基因组,形成大量大小不一的酶切片段,将这些片段与接头连接,取适量连接产物为模板,一端以接头引物,另一端以基因特异引物进行两轮嵌套PCR反应。李鹏丽等利用该方法分离了大豆中与衰老相关的类受体蛋白酶基因rlpk25′上游1801bp片段。功能分析表明,该启动子能驱动GUS基因在大豆幼苗生长点和番茄愈伤组织中瞬时表达,具有启动子活性。2.4.4基于生物活性的聚合酶链反应TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁侧的已知序列设计3个嵌套的特异引物(specialprimer,约20bp),用它们分别和1个具有低Tm值的短随机简并引物(arbitrarydegenerateprimer,约14bp)相结合,以基因组DNA作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应扩增特异产物。该技术最早由Liu等提出,此后由于该方法可以直接以基因组DNA为模板,高效快捷地克隆未知序列而得到广泛的应用。Zhang等用TAIL-PCR从白菜中克隆了一个新的PCP(pollencoatprotein)基因启动子,该启动子可以驱动GUS基因在花药壁、花瓣顶部及花药发育中后期花粉管中特异表达。Terauchi等改进了传统的TAIL-PCR方法,采用RAPD引物为随机引物,同时设计5个基因特异引物进行5轮嵌套PCR以增加反应的特异性,并用该方法获得了洋芋苯丙氨酸裂解酶基因5′上游序列,功能分析证实该片段能驱动目的基因表达,具有启动子活性。陈军营等在克隆小麦GLP3基因启动子时将传统TAIL-PCR的第1轮PCR反应的前10个降低严谨度的循环省去,分别延长了3轮PCR反应中的变性时间和延伸时间,同时增设了不同的退火温度,得到了1748bp的GLP3基因上游侧翼序列,测序结果表明该序列还有TATA-box、CAAT-box等核心启动子元件,为小麦GLP3启动子序列。3启动子功能分析方法3.1基于pr蛋白表达的5上游特定分子和分子身份证构建;PLACE(plantcis;PlantCARE(plantcis以及伯克利果蝇基因组计划软件(BerkeleyDrosophilaGenomeProject,BDGP)等。PLACE和PlantCARE是较常用作预测和分析启动子元件的数据库。朱廷恒等用PLACE软件分析了扩增到的OsPR-4b基因上游2257bp启动子序列,发现OsPR-4b基因起始密码子上游1.5kb的区域内存在几个可能与PR蛋白基因表达调控相关顺式作用元件,如W盒、PAL-boxA、GT-1结合序列、Dof结合序列和MybSt1元件等。杨英军等用启动子预测软件plantCARE对番木瓜proteinaseomega基因的5′侧翼序列分析发现,在翻译起始密码子上游存在着多个可能的TATA-box和CAAT-box;利用BerkeleyDrosophilaGenomeProject软件进一步对该5′上游远端调控序列分析发现,存在多个G-box、I-box和AT1-motif等光响应元件及逆境应答调控元件ERE、ABRE、HSE和WUN-motif等。宗成文等从藤稔葡萄基因组DNA中分离了LEAFY基因及其启动子序列共2692bp,用PLACE、PlantCARE在线启动子预测工具分析表明:该序列含有启动子基本结构,如TATA-box、CAAT-box等,另外含有一些顺式作用元件如MYB结合位点、ABA响应元件、光响应元件和一些其他的调控序列,说明葡萄LEAFY基因的表达可能受MYB、ABA和光等的调控;进一步对葡萄与拟南芥等其他4种植物的LEAFY同源基因启动子进行比较,发现不同植物的启动子既有保守性,又有多样性,转录因子结合位点的分布相似,但也有区别,暗示了LEAFY基因表达调控的精确性或多样性。3.2gus基因启动子生物学特性及与其他特殊基因的衔接用生物信息学初步预测和分析启动子序列后,进一步通过具体实验确定启动子上的顺式元件及其功能,通常是将启动子片段与报告基因融合构建表达载体转化离体培养细胞或植物体,检测报告基因在转基因个体中的表达情况具体分析启动子功能,明确顺式元件作用。常用于构建表达载体的启动子片段有5′缺失、3′缺失和点突变等,其中最常采用的是构建一系列5′缺失片段和报告基因融合的表达载体以进一步确定顺式作用元件的具体位置。刘昱辉等用PCR法扩增了profilin2启动子全长1667bp,构建了一系列5′缺失GUS融合表达载体转化伽蓝菜,GUS活性分析显示,全长启动子Pfn1.7具有维管束特异性。其中-1667~-1380bp区段缺失后,GUS基因由维管束特异表达变成组成型表达,据此推测该区段里包含维管束特异表达元件;-1153~-597bp区段有一个负调控元件,可强烈抑制GUS基因表达。目前常用的报告基因包括:β-葡聚糖酸醛苷酶基因(β-glucuron-idase,GUS)、绿色荧光蛋白基因(greenfluorescentprotein,GFP)、氯霉素乙酰转移酶基因(chloramphenicalacetyltransferase,CAT)等。其中由于GUS和GFP报告基因操作方便、易于检测和定性定量分析而被广泛使用。石东乔等将从甘蓝型油菜中分离的种子贮藏蛋白基因BcNA1的启动子与GUS基因相连构建了植物表达载体,农杆菌介导转化烟草,转基因烟草GUS基因检测分析表明,BcNA1基因启动子能特异地启动GUS基因在种子中表达,而且GUS酶活性随转基因烟草种子的发育而变化。张俊莲等将rd29A基因的启动子与GFP基因融合构建植物表达载体,用基因枪介导法转化置于不同类型培养基上的洋葱表皮细胞,对其进行不同温度培养,GFP基因瞬时表达水平结果表明,rd29A启动子对高盐和脱水逆境的响应较温度显著。除此之外,为进一步确定与顺式元件互作的蛋白及顺式元件的具体位置和序列,还可以用酵母单杂、凝胶阻滞及DNase1足迹实验等。Delaney等分离了一个棉花纤维特异表达启动子FSltp4,缺失分析发现了该启动子含有一个84bp的AT-rich区段(FSP),决定了其纤维特异性,并利用酵母单杂的方法分离了一个能和FSP特异结合的胚珠和非纤维组织特异表达的棉花纤维