正相色谱法分离纯化紫杉醇工艺研究

正相色谱法分离纯化紫杉醇工艺研究

紫杉醇是一个从蘑菇科植物中分离出来的二氧化合物。具有独特的抗癌机制。这是继阿霉素和铂之后的热点抗癌药物。1992年，美国食品和药物管理局（f）批准其作为抗晚期胃癌药物上市。紫杉醇在中国被用作两类西药。1995年10月，中国科学院药物研究所和海口制药厂获得了药品许可证，并成为中国世界上第二个正式生产紫杉醇及其注射液的国家。目前，在美国、英国和荷兰等40多个国家，紫杉醇是一种重要的抗高血压药物。目前，世界上约600公斤紫杉醇原药，年销售额超过30亿元人民币。目前,药用紫杉醇获取主要来源于天然植物——红豆杉的提取,由于这些植物数量极少,种群密度小,自身繁殖度低,生长缓慢,且紫杉醇在这些植物树皮中的含量又极低,仅从天然植物——红豆杉中获取紫杉醇必将给红豆杉属植物在自然界中的长期留存带来极大的危险.在这种情况下,人们利用现代科技手段,正在为充分有效地利用现有的资源获得具有独特抗癌机制的天然产物——紫杉醇而努力.正相色谱过程分离纯化紫杉醇工艺的突出优点是固定相价格低廉,用硅胶作为固定相即可,而且洗脱所用流动相多为挥发性很强的有机溶剂,溶剂回收简单、能耗低.鉴于正相色谱的这些优点,开发一种适合我国实际情况的紫杉醇分离纯化工艺,具有很大的社会和经济效益.1材料和方法1.1气相色谱-质谱hplc-msp本研究以规模制备为背景,所用的有机溶剂均为市售的工业品,使用时自行精制除去不挥发残留.实验用细孔100目硅胶,购自上海硅胶厂,拌样用硅藻土采用上海金山漕泾化工厂,120目.分析检测用TLC法结合HPLC法,TLC法采用EMERCK公司生产的铝制60F254硅胶板,板上硅胶厚度0.2mm,HPLC为岛津SCL—14Avp液相色谱仪,检测器型号SPD—10Avp.流动相(体积比)甲醇∶水(65∶35),流速1.0mL/min.表1和图1分别为红豆杉浸膏样品色谱图谱及色谱图谱的积分面积结果.1.2样品的预处理浸膏样品中含有大量杂质,它们在液相色谱固定相上的竞争性吸附甚至不可逆吸附会导致固定相用量增加,目标产物的分离度降低,分离效率低下等,因此,在分离纯化的早期阶段就使用色谱过程是不经济的.对样品选择合适的方法进行预处理,提高目标产物的浓度,在生产率和操作控制方面都会带来必要的方便.1.2.1固液萃取去除非极性杂质浸膏样品来源于树皮、枝叶或植株体的其他部位,除含量很低的目标产物紫杉醇外,还含有各种类型的极性和非极性杂质.在获得浸膏的粗提过程中,已去除一大部分杂质,但仍有相当部分带入进来.这部分杂质中,一些低极性或非极性类杂质如焦油等,会黏附在作为色谱固定相的硅胶上,使硅胶失去吸附能力,而且随流动相洗脱夹带下来后,又会给洗脱馏分的干燥带来困难.对于这类杂质,可采用低极性的醚类和烷类有机溶剂进行固液萃取除去.本研究采用正己烷(60～90℃)对浸膏进行固液萃取.其结果见图2.随正己烷用量的增加,萃取的杂质百分率也在增加,但当正己烷的用量达到原始浸膏的5倍时,被萃出的杂质百分数则不在有明显变化.因此,萃取液与紫杉醇浸膏的质量比,5倍体积的正己烷可以认为是一个优化的值.综合以上研究,可得固液萃取除去非极性杂质的优化条件是:在温和的匀浆搅拌条件下,按体积质量比5倍体积的正己烷可除去10%～12%的杂质.固液萃取过程目标产物紫杉醇的收率为100%.1.2.2等体积碱洗前后浸膏碱洗效果的比较将经正己烷固液萃取后的浸膏样品用一定浓度的Na2CO3溶液洗涤.由于植株体中含有大量鞣质酸等其他一些酸类杂质易和碱溶液发生一种类似皂化的反应,生成一些易溶于水的物质,可以通过用水洗涤除去.但紫杉醇在碱性环境中极其不稳定,很快裂解成巴卡亭Ⅲ和其他一些物质.基于这一事实,本研究中采用乙酸乙酯做溶剂,用0.5mol的Na2CO3溶液裂解紫杉醇预计制备少量巴卡亭Ⅲ的过程中发现,紫杉醇在碱洗的前后没有发生任何变化,这一裂解反应没有达到预期目的,但为紫杉纯的纯化找到了一种切实可行的方法.可以认为乙酸乙酯作为溶剂的水解反应可以屏蔽紫杉醇的裂解反应.图3为不同浓度Na2CO3溶液对经正己烷固液萃取后浸膏样品进行碱洗的结果,浸膏用10倍体积的乙酸乙酯溶解,加入等体积碱溶液.图中显示,Na2CO3浓度增加时,被去除杂质的百分率也增加,但当Na2CO3溶液浓度增加到0.5mol以上后,再增加则无明显影响.而且,由于酯的水解,Na2CO3浓度过高使有机溶剂消耗量变大,因此,0.5mol较为合适.同样,碱溶液用量也有类似影响,根据实验结果,以等体积较好.作为最为直接的证据,将碱洗前后浸膏样品的图谱结果见图4、5.比较图4和图5可知,碱洗前后浸膏样品的图谱几乎没有变化,可知碱洗主要除去一些在227nm或233nm处没有吸收峰的杂质,而紫杉醇则不受影响.碱洗过程具体操作为:用10倍体积乙酸乙酯溶解适量浸膏;加入等体积0.5mol的Na2CO3溶液,搅拌10～20min:分相后,有机相用0.5倍Na2CO3溶液体积的蒸馏水洗涤2次.其中第二次洗涤常伴有乳化现象,需加入适量盐,过程中乙酸乙酯因水解大约损失一半;洗涤后有机相用无水硫酸钠进行脱水,根据后面工序的需要减压浓干或浓缩至25%～30%的有机相体积.这一步骤可去除最高达60%的杂质(以正己烷固液萃取后干浸膏量为基准),因乙酸乙酯少量溶于水使紫杉醇有所损失,收率在97%以上.1.3紫杉醇的色谱分离纯化碱洗浓缩后的产物,除一些难以去除的色素外,杂质含量主要是一些紫杉烷类化合物,其中不乏价值很高的紫杉醇类似物如Cephalomannine,巴卡亭Ⅲ等,同样需要分离纯化.在一个工序中能分段收集这些化合物,层析过程是最佳选择.因为目标产物的含量还很低,尤其伴随有结构性质相似的类似物Cephalomannine,一次层析将紫杉醇纯化到预定的纯度难度很大,而且也不经济.比较合理的方法是,先用一个层析过程粗分一下,使收集的馏分中目标产物有较高的含量,为进一步分离纯化奠定基础.因为这步层析仅是粗分,对色谱柱高径比的要求不是太大,硅胶用量也不必太高,而且可以使用较高的洗脱速度.1.3.1流动相的选择洗脱过程中可以通过采用极性较强的溶剂和极性较低的溶剂混合调整极性来改变洗脱强度.因为浸膏样品中紫杉烷类物质种类多,极性差别很大,以梯度洗脱较为合适.但连续梯度操作非常烦琐,考虑到实际操作的方便,采用分段梯度操作最为适宜.丙酮和己烷均易挥发,且均属于无毒的有机溶剂,回收容易.本研究选择己烷/丙酮体系为流动相.1.3.2粗沙/玻璃珠的制备经上述除理的样品在己烷/丙酮作为流动相的洗脱剂中溶解度不是很大,以固态上样法较为合适.其样品制备操作如下:将样品按1∶10(g/mL)的比例溶解在丙酮中,然后加入5倍量(以浸膏样品质量为基准)的硅藻土,拌匀后自然风干.或将该混合物在40℃以下烘干即得固体样品.洗脱操作时,将样品放在色谱柱上部,并在样品上端覆盖一层粗沙或玻璃珠,以防止样品界面被破坏.待洗脱.1.3.3洗脱结构及条件洗脱模式可选用干柱色谱法进行初步估计.干柱色谱法是将干的吸附剂装入色谱柱中.将待分离的样品配成浓溶液或吸附于少量填料上,然后上样.当洗脱液依靠毛细作用从柱上流下,接近色谱柱底部时,停止洗脱,将吸附剂分段从或根据色带位置挖出或切开,用适当的溶剂洗出.这种方法溶剂消耗量少,所需时间短,可根据目标产物在柱中的位置确定洗脱模式.图6是不同流动相洗脱条件下目标产物紫杉醇在柱中的位置,图6仅是一个示意图,只显示了紫杉醇色斑的大致位置,杂质的色斑没有绘出.本研究采用的色谱柱是由容量为10mL,内径10mm,高接近7cm的医用针管制成.上样量0.1g,溶于1mL丙酮,拌入0.5g硅藻土,风干,柱内硅胶分段洗脱后用TLC分析确定色斑位置.图6中横坐标表示色谱柱的轴向位置,最小刻度对应柱的下端出口,流动相为正己烷/丙酮体系,其比例(体积比)见图6.根据图6,可大致判断一下洗脱梯度的模式,在己烷/丙酮为8∶2时,紫杉醇的谱点几乎不移动,到7∶3时,紫杉醇能够被洗脱,但谱点移动速度很慢,如果己烷/丙酮体积比加达到6∶4,紫杉醇斑点接近柱出口端,表示6∶4的己烷/丙酮对紫杉醇有足够的洗脱强度.至此,洗脱结构可初步设定为,以8∶2或7∶3的己烷/丙酮起始,洗脱一些吸附能力较差的色素和一些极性较低的紫杉烷类物质,以6∶4完全洗脱紫杉醇后结束.为使谱带更好的分离,可以根据实验结果在中间加入合适的梯度.考虑到有一些极性很强的紫杉烷类物质如DAB等,可在6∶4的梯度结束后,再进行一次洗脱强度更大的梯度以回收副产物,最后用纯丙酮代潜硅胶循环使用.在洗脱模式初步确定后,可进行实验进一步确定洗脱模式.本研究实验采用的色谱柱:内径16mm,柱轴向高度200mm,柱下端有旋塞;硅胶用量5g,采用敲击装填法干法装柱,堆密度按0.5g/mL计,柱有效床层为l0mL;上样量为0.5g,5mL丙酮溶解,拌入2.5g硅藻土,风干;洗脱速度用气压球控制在2mL/min.最佳操作模式:一次层析中洗脱模式的优化选择为:2BV(bedvolumn)70∶30+3BV65∶35+3BV60∶40(正己烷:丙酮).最后,根据浸膏样品中回收副产物要求,可适当再增加洗脱梯度.1.3.4难以进行下一步分离一次层析过程中固定相的合适用量可以用硅胶和处理的浸膏质量比作为参数进行表征.硅胶用量太小,分离效率低,各馏分之间交叉较多,难以进行下一步分离;而硅胶用量太大,在达到粗分的前提下又会造成浪费.按照下操作过程(结晶)的要求,该层析过程中要求目标产物紫杉醇的纯度要在30%以上,而且要求紫杉醇所在馏分和前后馏分的交叉要尽可能小,否则影响下一次操作的收率.该一次层析过程,硅胶用量与浸膏质量比为10∶1时效果最佳.研究表明,有限的增加硅胶用量难以有效提高一次层析的效果,只会使溶剂消耗量增大.1.3.5柱切换技术的应用如果直接将样品加在色谱柱柱顶,除了洗脱时会增加柱压外,在第一次操作结束,进入下一个循环时,需要取出上一次承载样品的硅藻土,非常烦琐,尤其在大规模生产时,频繁拆装色谱柱会影响生产进程.柱切换技术可以解决这一问题,将色谱柱设计成两段,一段较短粗,负载承载浸膏样品的硅藻土,另一段高径比较大,是层析过程的有效段.洗脱过程中在线或间隔检测洗脱液,发现负载样品的柱段中没有目标产物时,可用一个转换阀直接将流动相导入层析过程的有效段,同时拆装样品柱,装载下一次样品.由于承载样品用的硅藻土是一种失活的吸附剂,少量流动相便可以将目标产物洗脱完全.实验中发现,当硅藻土用量和浸膏比为5∶1时,按前面优化的洗脱结构,用3BV硅藻土床层体积的流动相便可以将目标产物完全洗脱.层析因硅胶的不可逆吸附使目标产物有所损失,其收率约为95%.1.4紫杉醇的结晶、分离、萃取工艺在甲醇/水体系中的分离和利用粗分后目标产物能否进行结晶是衡量粗分结果的标准.结晶体系可以选用甲醇/水或乙醇/水,但乙醇对紫杉醇的溶解能力较差,处理量小,以甲醇/水体系较佳.将一次层析中含目标产物紫杉醇的馏分蒸干后,按8mL/g的比例溶解在甲醇中,水浴加热到50℃,同时在搅拌的情况下缓缓滴入三分之一甲醇体积的双蒸水,冷却48h以上可得呈白色发黄的针状晶体,这一步紫杉醇的纯度可达50%～70%,收率95%以上.将结晶后母液用适量乙酸乙酯萃取,脱水蒸干后,与下一批物料累积循环处理,可提高总收率.1.5cephal妇人nine的溴加成反应Cephalomannine是紫杉烷类物质中结构和性质与紫杉醇最为相似的物质,非常难以分离,但它们仍有一些可供利用的不同之处.在温和条件下,Cephalomannine易发生溴加成,而紫杉醇则无此反应.利用Cephalomannine和紫杉醇结构中的这一差异,采用溴加成的方法改变Cephalomannine其分子的极性,可大大降低Cephalomannine和紫杉醇分离的难度.Cephalomannine的溴加成反应是可逆的,在乙酸条件下,用锌粉就可以将Cephalomannine还原回来,这一点是臭氧化工艺所不能比拟的.反应以在氯仿中进行为好,但氯仿的储存过程一般要加入乙醇作稳定剂,否则易分解产生光气.乙醇的存在使反应无法进行,所以对氯仿要进行处理.用浓硫酸洗涤氯仿,然后用水洗涤2次,无水硫酸钠对氯仿相进行脱水后最后进行蒸馏,可得不含稳定剂的氯仿.溴加成具体的操作为:按1/30(g/mL)的比例将一次层析得到的粗品加入氯仿中溶解,搅拌情况下快速滴入少量溴素,室温下反应5min停止;用10%的Na2S2O3溶液淋洗去除未反应掉的溴素;用水或盐水淋洗两次,无水硫酸钠脱水后蒸干,样品进入下一个工序.图7和图8是溴加成前后样品图谱的比较,从中可以体会到溴加成的效果.溴加成的收率为95%.1.6紫杉醇的手性异构体Cephalomannine经溴加成后的产物极性发生了变化,需再经一次硅胶色谱柱实现和紫杉醇的分离.选用毒性较小的己烷/乙酸乙酯为洗脱体系.此时的样品中杂质除一些色素和Cephalomannine溴加成后的产物外,还常常含有一种紫杉醇的手性异构体7—epi—taxol,它7位的基团和紫杉醇呈手性异构,性质非常相似.研究发现,当色谱柱的长径比在8∶1以上,干法装柱,固定相硅胶用量和样品的质量比为30∶l时,紫杉醇和7—epi—taxol能够实现较好的分离.洗脱模式用干柱色谱结合小规模实验证实以己烷/乙酸乙酯60/40(3BV)～55/45(2BV)～50/50(5BV)为佳.从最初的正己烷固液萃取到溴加成后,样品量已经很小,所以二次层析过程中的固定相用量和