猪瘟活疫苗(传代细胞源)成品检验课件

猪瘟活疫苗（传代细胞源）

成品检验内容：共有九个质量项分别是：物理性状检验、无菌检验、支原体检验、鉴别检验、外源病毒检验、安全检验、效力检验、剩余水分测定和真空度测定。

1物理性状检验本品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。

2无菌检验1按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。2用T.G培养基50ml，接种疫苗（先做10倍稀释）1ml，置37℃培养，3日后吸取培养物，分别接种T.G小管和G.A斜面各2支，每支0.2ml，1支置37℃，1支置25℃，另取0.2ml，接种一支G.P小管，置25℃，均培养7日，应无菌生长。

无菌检验-抽样

1应随机取样并注意代表性。2按每批或每个亚批进行，每批按瓶数的百分之一抽样，但不应少于5瓶，最多不超过10瓶，每瓶分别进行检验。3支原体检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无支原体生长。检测猪瘟活疫苗（传代细胞源）用支原体培养基（见《中国兽药典》附录24、25页）。3.1样品处理：每批制品取样5瓶，加液体培养基或生理盐水复原成混悬液后混合。3.2接种与观察：每个样品需同时用以下两种方法检测。3支原体检验3.2.1液体培养基培养将疫苗混合物5.0ml接种装有20ml液体培养基的小瓶，摇匀后，再从小瓶中取0.4ml

移植到含有1.8ml培养基的2支小管（1.0cm×10cm），每支各接种0.2ml，将小瓶与小管置37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从小瓶中取0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察14日后停止观察。3支原体检验3.2.1在观察期内，如果发现小瓶或任何一支小管培养物颜色出现明显变化，在原pH值变化达±0.5时，应立即将小瓶中的培养物移植于小管液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。

3支原体检验3.2.2琼脂固体平板培养在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1~0.2ml接种于琼脂平板，置含5%~10%CO2、潮湿的环境、37℃下培养。在液体培养基颜色出现变化，在原pH值变化达±0.5时，也同时接种琼脂平板。每3~5日，在低倍显微镜下，观察检查各琼脂平板有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落者时，停止观察。3支原体检验3.3每次检查需同时设阴、阳性对照，在同条件下培养观察。检测猪瘟活疫苗（传代细胞源）疫苗，用猪鼻支原体作为阳性对照。3.4结果判定3.4.1接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判疫苗不合格。3.4.2阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。3支原体检验3.4结果判定3.4.1接种样品的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判疫苗不合格。3.4.2阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。4鉴别检验中和试验将疫苗用灭菌生理盐水稀释成为每毫升含有100个兔MID的病毒悬液，与等量的抗猪瘟病毒特异性血清充分混合，置10~15℃作用60分钟，其间振摇2～3次。同时设立病毒对照和生理盐水对照。4鉴别检验注射、观察与判定中和结束后，分别耳静脉注射兔2只，每兔1.0ml，按效力检验（1）项进行观察和判定。除病毒对照组应出现热反应外，其余2组在接种后120小时内不出现热反应。5外源病毒检验按现行《中国兽药典》附录进行检验，应无外源病毒污染。5.1样品处理取样品2~3瓶，将样品混合，用相应的特异性阳性血清中和后作为检品。5.2细胞的选择与样品培养5.2.1细胞的选择Vero、MDBK、ST传代细胞5外源病毒检验5.2.2样品的接种与培养（1）至少1.0ml（制品至少含10头份）已处理被检样品应接种到已长成良好单层的上述细胞，另至少设一瓶正常细胞对照。（2）细胞培养物传代方式：上一代细胞培养物冻融3次后接种新细胞单层的方式继代，至少继代一次，总培养时间应不少于14日。最后一次继代的细胞单层数量和培养面积应符合荧光抗体检查法、致细胞病变检查法和红细胞吸附性外源病毒检验的要求。5外源病毒检验

5.2.3判定在至少14日的培养期内，要对细胞培养物进行常规检查，如果培养期间出现细胞病变，则判为不符合规定。如无细胞病变，培养结束时，细胞单层应按5.2.4进行检验。

5外源病毒检验5.2.4检查方法使用BVDV、PPV荧光抗体。5.2.4.1荧光抗体检查法最后一次继代的细胞单层应培养5~7日后用于荧光抗体检查。对每一种特定外源病毒的检验应至少含三组细胞单层：（1）被检样品细胞培养物；（2）在最后一次继代时接种100~300FAID50特定病毒的阳性对照；（3）正常细胞对照。每一组细胞单层检查面积应不小于6.0cm2。5外源病毒检验荧光检查判定细胞单层样品经丙酮固定后，用适宜的荧光抗体进行染色，检查每一组单层是否存在特定外源病毒的荧光。当阳性对照出现特异荧光，正常细胞无荧光时，如果被检样品出现外源性病毒特异性荧光，判为不合格。如果阳性对照组荧光不明显，或者正常细胞出现不明显荧光，判为无结果，应重检。5外源病毒检验5.2.4.2致细胞病变检查法取经传代培养至少7日的敏感细胞单层（每个至少6.0cm2

）进行检验。用适宜染色液对细胞单层进行染色。观察细胞单层，检查包涵体、巨细胞或其他由外源病毒引起的CPE的出现情况。如果出现外源病毒所致的特异性CPE，判为不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为不合格。5外源病毒检验5.2.4.3红细胞吸附性外源病毒检验取经传代后至少培养7日的细胞单层（每个至少6.0cm2

）进行检验。以PBS洗涤细胞单层2~3次。加入适量0.2%的豚鼠红细胞和鸡红细胞的等量混合悬液，以覆盖整个单层表面为准，红细胞悬液可在加入前混合，亦可分别滴加于不同的细胞单层上。5外源病毒检验5.2.4.3选2个细胞单层，分别在2~8℃和20~25℃放置30分钟，用PBS洗涤，检查红细胞吸附情况。若出现外源病毒所致的红细胞吸附现象，判为不合格；若疑有外源病毒污染，又不能通过其他试验排除这种可能性时，则判为不合格。6安全检验6.1猪瘟病毒中和试验方法6.1.1先测定猪瘟病毒兔化弱毒(抗原)对兔的最小感染量（MID）。试验时，将抗原用灭菌生理盐水稀释成100个兔MID/ml，作为工作抗原(如果抗原对兔的MID为10-5.0/ml，则将抗原稀释成1000倍使用)。6安全检验

6.1.2将被检猪血清分别用灭菌生理盐水作2倍稀释，与含有100个兔MID/ml的工作抗原等量混合，摇匀后，置10~15℃中和2小时，其间振摇2~3次。同时设含有相同工作抗原量加等量生理盐水(不加血清)的对照组，与被检组在同样条件下处理。6安全检验6.1.3中和完毕，被检组各注射兔1~2只，对照组注射兔2只，每只兔耳静脉注射l.0ml，观察体温反应，并判定结果。6安全检验6.1.4结果判定体温反应标准同效力检验项。当对照组2只兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另一只兔呈轻热反应(+)时，方能判定结果。被检组如果用1只兔，须呈定型热反应；如果用2只兔，每只兔应呈定型热或轻热反应，被检血清判为阴性。6安全检验6.1.5注意如被检组用2只兔，其中1只兔无反应或呈可疑反应时，可采血复归或对2只兔进行攻毒。如被检血清出现阳性反应或复归兔仍为可疑反应时，则该头被检猪不得用于猪瘟疫苗的安全(或效力)检验。被检组用1只兔时，不得复归或攻毒。用中和试验方法选择易感猪，无论是否同窝猪，均须逐头检测。6安全检验6.2测常温及安全检验注射剂接种前观察5～7日，每日上、下午各测体温1次。挑选体温、精神、食欲正常的易感猪使用。每批疫苗按瓶签注明头份用灭菌生理盐水稀释成每毫升含6头份，肌肉注射猪5头，每头5.0ml(含30头份)。6安全检验6.3测温及判定接种后，每日上、下午各观察并测体温1次，观察21日。体温、精神、食欲与接种前相比没有明显变化；或体温升高超过0.5℃，但不超过l℃，稽留不超过4个温次；或减食不超过l日，疫苗可判为合格。如果有l头猪体温超过常温l℃以上，但不超过1.5℃，稽留不超过2个温次，疫苗也可判为合格。6安全检验6.3测温及判定如果有1头猪的反应超过上述标准；或出现可疑的其他体温反应和其它异常现象时，可用5头猪重检1次。重检的猪仍出现同样反应，疫苗应判为不合格。6安全检验6.3测温及判定也可在猪高温期采血复归猪2头，每头肌肉注射可疑猪原血5.0m1，测温观察16日。如果均无反应，疫苗可判合格。如果第1次检验结果已经确证疫苗不安全，则不应进行重检。7效力检验下列方法任择其一7.1用兔效检按瓶签注明头份，用无菌生理盐水将每头份疫苗稀释1/7500头份/ml，耳静脉注射体重为1.5～3.0kg兔2只，每只l.0ml。接种后，上、下午各测体温1次，48小时后，每隔6小时测体温1次，根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。7效力检验7.1.1兔接种疫苗后，体温反应标准如下：定型热反应(++)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有3个温次超过常温1℃以上，并稽留18～36小时。如稽留42小时以上，必须攻毒，攻毒后无反应可判为定型热。轻热反应(+)潜伏期48～96小时，体温上升呈明显曲线，至少有2个温次超过常温0.5℃以上，并稽留12～36小时。可疑反应(

)潜伏期48～96小时，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时；或潜伏期在24小时以上，不足48小时及超过96小时至120小时出现热反应。体温反应呈二次高峰，有一次高峰符合定型热反应(++)或轻热反应(+)标准者，均须攻毒。攻毒后无反应时，该兔热反应可判为定型热或轻热反应。无反应(－)体温正常。7效力检验7.1.2结果判定：注苗后，当2只兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时，疫苗判为合格。注苗后，当1只兔呈定型热反应(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(

)；或2只兔均呈轻热反应(+)时，可在注苗后7～10日攻毒(接种新鲜脾淋毒或冻干毒)。攻毒时，加对照兔2只，攻毒剂量为50～100倍乳剂。每兔耳静脉注射1ml。7效力检验攻毒后的体温反应标准如下：热反应(+)潜伏期24～72小时，体温上升呈明显曲线，超过常温1℃以上，稽留12～36小时。可疑反应(

)潜伏期不到24小时或72小时以上，体温曲线起伏不定，稽留不到12小时或超过36小时而不下降。无反应(－)体温正常。攻毒后，当2只对照兔均呈定型热反应(++)，或1只兔呈定型热反应(++)，另1只兔呈轻热反应(+)，而2只注苗兔均无反应(－)，疫苗判合格。7效力检验注苗后，如有1只兔呈定型热(++)或轻热反应(+)，另1只兔呈可疑反应(

)或无热反应(－)