第四章 基本常用技术

第四章细胞培养中的基本方法细胞培养技术第一节无菌技术防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。由于体外培养细胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的无菌。细胞培养工具做到细胞培养专用进出细胞培养室做到更衣换鞋超净工作台紫外照射时不要放置过多物品遮挡紫外线一、操作区消毒1.使用紫外线灯灭菌，照射细胞培养室和超净工作台20-30min。2.在用紫外线灯照射期间，超净工作台上放置物品不要过多，留有死角阻碍照射，勿置培养细胞和培养用液等物，以免受射线影响(必要时可用纸张覆盖)。3.所有操作用具（包括培养瓶）要经75%的乙醇擦拭后才可放置进超净工作台内。4.实验开始前使用75%的乙醇擦拭超净工作台台面。二、洗手和着装1.进入细胞培养室更换专用室内鞋和无菌服、帽子和手套。2.使用75%酒精或0.2%的新洁尔灭洗手。3.实验过程中可能触及污染物品或者出入培养室均要洗手。三、火焰消毒1.在无菌环境进行培养或做其它无菌操作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作,需要在酒精灯附近进行。2.实验中使用器械均要经过火焰烧灼进行。3.金属器械不宜灼烧长，防止退火和过热。4.含营养液的吸管不要灼烧防止营养液碳化。5.培养瓶口过火时间不要太长防止烧死细胞。四、培养操作1.操作台面布局合理2.不用手触及已消毒物品3.操作保持一定顺序，动作准确敏捷4.组织或细胞在未做处理前或培养液在未用前，勿过早暴露在空气中；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口。5.防止各种用液的交叉污染。6.不向操作方向讲话或咳嗽原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。意义:1.原代培养的最大优点是细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体的遗传性，而且大多数细胞表现出原来组织的特性。2.利用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化及病毒学方面的试验效果很好。3.原代培养也是建立各种细胞系（株）必须经过的阶段。第二节原代培养取材原则：1.幼体组织尤其是胚胎组织比年老个体的组织容易培养；2.分化程度低的组织比分化程度高的容易生长；3.肿瘤组织比正常组织容易培养。4.取材之后，最好立即培养，如因故不能培养时，应把组织切成1立方厘米左右的小块，置于培养液中，4℃贮存，存放时间不宜超过24小时。5.从体内取材时，应严格保持无菌，避免受到紫外线照射或接触任何化学试剂及有害药物如碘、汞等。取肿瘤和其它病理组织时容易带菌，为减少污染，可用含500-1000单位／毫升的青、链霉素BSS液，漂洗5-10分钟后再做培养处理。取鼠胚组织引颈法处死小鼠整个小鼠浸入75％酒精中2~3秒钟打开胸腔取出组织组织的分离：从体内取出的各种组织均由众多细胞和纤维成分组成，而且结合十分紧密。为获取多量生长良好的细胞，必须把组织细胞分散开，使细胞解离出来。机械法化学法机械法：把组织块先剪成小块后，把组织放入注射器针管中使用压挤法，或是把组织置于不锈钢纱网中用钝物压取法。其中以压取法较多用。简便易行，节省时间，但对组织有一定损伤，仅适用于处理软组织。化学法：在把组织剪切成较小体积的基础上，应用生化和化学手段进一步分散组织，最后制成细胞团或单个细胞悬液接种的方法。最常用的消化酶是胰蛋白酶和胶原酶两种。93原代细胞培养结果细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡。传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化。第三节传代培养贴壁细胞的传代培养1.选取生长良好的细胞，倒去瓶中的旧培养液，加入2～3ml的PBS，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。2.加入适量0.１％－0.25％胰蛋白酶消化液，室温消化，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。3.用Hanks液洗涤1次，加入适量培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。4.使用台盼蓝进行细胞计数，按照计数结果进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃，5%CO2培养。5.24h后观察的生长情况。悬液细胞的传代培养1.取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。2.转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1000r/min）5min。3.在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。4.使用台盼蓝计数，按照结果进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37℃，5%CO2培养。5.24h后观察的生长情况。细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术，是用于了解培养细胞生长状态，测定培养基、血清、药物等物质对细胞发挥作用的重要手段。

血球计数板计数法

电子细胞计数仪计数法

第四节细胞计数方法和步骤1.取酒精棉球清洁计数板和专用盖玻片，并用丝绸布或擦镜纸轻轻拭干。2.用胰酶消化分散贴壁细胞或直接收集悬浮细胞制成均匀分散的单细胞悬液，必要时应进行适当的稀释或浓缩。3.混匀后直接取少许细胞悬液，沿计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液。加样量以充满不外溢为宜，也不要过少或出现气泡。4.统计四个大格的细胞数：将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察，并移动计数板，分别数出四角的四个大格（每个大格含有16个中格）中的细胞数。对压边线细胞：计上不计下，计左不计右

计算：一般以每毫升含细胞数来表示大方格的面积为1mm2，室深为0.1mm，则体积为0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才为1ml体积。所以计算公式为：细胞悬液的细胞数）/ml＝（

四个大格子细胞数/4)

×104

×稀释倍数计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少,可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。不要漏计，不要重复，细胞悬液应混合均匀，浓度不可过高也不可过低。细胞生长曲线的绘制细胞生长曲线(cellgrowthcurve)是观测细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，可根据细胞生长曲线分析细胞增殖速度，确定细胞传代、细胞冻存或具体实验的最佳时间。它以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。制作方法：1.培养细胞

首先在2４孔培养板内分别接种相同数量的细胞。计数并记录接种的细胞悬液之密度。接种时间记为0h。2.计数细胞密度

从接种时间算起，每隔24h计数３孔内的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2～3次。如此操作至第七天结束。3.绘制曲线以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。培养细胞的生长曲线第五节活细胞的染料排除检测法原理：由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却不被排出，因而细胞呈色。而活细胞反之，能排出进入细胞内的染料，因而不易着色。此法的原理即是利用死、活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞。最常用的为“台盼蓝排除检测法”

实验方法：1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。

2、加入0.5ml0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。

死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。台盼蓝染细胞时，时间不宜过长。否则，部分活细胞也会着色，会干扰实验结果。

1776年，

“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。

1900年前后，基本上肯定了生物成分(如精子)能够在零下温度贮存。

1949年，发现了甘油对低温下贮存细胞的保护作用。

1959年，发现了一种新的化学保护剂，这就是现在常用的二甲基亚砜(DMSO)。

当前低温液氮冻存贮存细胞已是细胞培养室常规性通用技术，贮存时间几乎是无限的。

第七节、细胞的冻存与复苏一、培养物的冷冻保存与复苏原理冷冻保存(cryopreservation)：将体外培养物悬浮在加有冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度(一般是低于-70℃的超低温条件)，并在此温度下对其长期保存的过程。复苏(thawing)：是以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。

细胞冻存时，存在两种损伤：冰晶损伤溶质损伤

冰晶损伤：由于温度下降，细胞内外的水分都会结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内、外结冰而致的细胞损伤被称为细胞的冰晶损伤。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。

溶质损伤：因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶质损伤。细胞悬浮在溶液中，随着温度的下降，细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质的浓度升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长，细胞膜上脂质会受到损坏，细胞便发生渗漏。

溶质损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。如果在溶液中加入冷冻保护剂时，则可保护细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。保护机理：冷冻保护剂易同溶液中水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的形成；通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质的浓度，使细胞免受溶质的损伤，细胞得以在超低温条件下保存。

影响冷冻效果的因素有以下几点：

1.冷冻速率

当冷冻速度过慢时，细胞脱水严重，细胞体积严重收缩，超过一定程度时即失去活性。冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶质损伤。当冷冻速度过快时，细胞内水分来不及外渗，会形成较大冰晶,造成细胞膜及细胞器的破坏，产生细胞内冰晶损伤。2.冷冻保存温度：液氮温度(-196℃)是目前最佳冷冻保存温度。应用-70℃～-80℃条件冷冻保存细胞，短期内对细胞活性无明显影响，但随着冻存时间延长，细胞存活率明显下降。

4.冷冻保护剂（渗透性

非渗透性）：

渗透性常用甘油、DMSO

渗透到细胞内，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而保护细胞免受高浓度电解质的损伤；同时，细胞内水分也不会过分外渗，避免了细胞过分脱水皱缩。甘油和DMSO并不能防止细胞内结冰。在使用该类冷冻保护剂时，需要一定的时间进行预冷。目前，DMSO的应用比甘油更为广泛。

非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质。该类保护剂主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羟乙基淀粉等。大分子物质可以优先同溶液中水分子相结合，降低溶液中自由水的含量，使冰点降低，减少冰晶的形成；使溶液中电解质浓度降低，从而减轻溶质损伤。二、使用逐级降温法进行冻存1.主要材料(1)仪器设备：普通冰箱、-30℃低温冰箱和-70～-80℃超低温冰箱、液氮冻存罐、离心机等。(2)冻存管：容量为2ml。(3)冷冻保护液：一般是以含20%小牛血清的细胞培养液与二甲基亚砜1份以9：1混