方法学验证的相关内容学习

方法学验证的相关内容学习内容提要：（方法学验证的应用、依据、类型、一般参数、要求）验证应用：方法验证是对测定方法的评价，是建立新方法的研究内容和依据。（新建方法、已建立方法的修订验证、已建方法的复现）验证依据：方法应用领域对方法验证要求的“指导原则”验证类型：全部验证Fallvalidation、部分验证Partialvalidation、交叉验证crossvalidationFullvalidation第一次新建方法；一个已建方法，但增加分析对象（精密、回收）。Partialvalidation（已建方法的部分改变）1） 分析方法改变（检测器改变）；2） 生物样品（抗凝剂改变）；3） 基质改变（血一尿）；4） 前处理方法改变；5） 生物样品种属改变（rat大鼠一mouse小鼠）；6） 仪器改变工作软件改变；7） 稀有生物样品，取样量有限。Crossvalidation样品分析在不同场所或实验室进行时，不同实验室需进行加样生物样品或实际样品分析，建立实验室间的重现性数据。当分析数据由不同检测技术产生时LC-MSvsELSD需交叉验证部分验证：准确度，精密度（都做）交叉验证：加样准确度，实际样品分析（任一）一般参数：精密度precision:同一匀质样品的一组测量值，彼此符合的程度。1） SD标准偏差standarddeviation2） %RSD相对标准偏差relativeSD，CV变异系数n>8标准差SD=开方（求和（xi—x均值）/（n-1））%RSD=SD/x均值X100%日内精密度（intradayprecision）：同一次测定，7〜10份，按方法做。测定，SD值，RSD限度（生物制品5%，药品2%）。日间精密度（interdayprecision）：不同一次测定，7〜10份，按方法做。测定，SD值，RSD限度（生物制品15%，药品5%）。准确性accuracy：结果与真值的接近程度，表示分析方法测定的正确性，通常用回收率实验表示（加样回收率）。回收率=（测定液测定值一原样液含测值）/加入量值X100%灵敏度：检测限(limitofdetectionLOD)：分析方法能从背景信号中区分出药物，所需样品中药物的最低浓度，LOD反映方法与仪器的灵敏度和噪音也表明样品经处理后本底值的高低。S/N>3定量限(limitofquantitationLOQ)在保证具有一定可靠性(一定准确度和精密度)分析方法能够测定出样品中药物的最低浓度。反映分析方法测定含药物的低浓度样品时的可靠性。选择性(selectivity)：分析方法从其他成分中区分并定量目标成分的能力专属性(specificity)：指一种方法仅对一种分析成分产生唯一信号选择性(selectivity)：指一种方法可对多种成分产生不同响应，主要成分响应可与其他成分区分选择性的区分选择内容：化药：杂质、降解产物、相关化合物、制剂辅料(可通过空白比较和添加法所得分析结果比较确定)体内药物：内源性物质、代谢物、分解产物、分析中的相伴物、内源性代谢物体内药分的选择性内容：空白生物样品(血尿、胆汁等、至少六个来源的生物样品(非MS方法)、每个空白样品均测定干扰和LOQ。线性(liner)：给定范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力线性范围是指利用一种方法取得精密度、准确度均符合要求的试验结果，而且呈线性的供试物浓度的变化范围其最大、最小量间的间隔。浓度范围包括5-8个浓度点，标准曲线应覆盖样品浓度范围。药物一般80-120%(但低限不低于LOQ)体内药物、浓度上线高于样品最高浓度，下限为LOQ相关系数(r)表示了线性度r30.9900重现性(Repeatibility)相同方法在正常条件下多次重复测定同一匀质样品所得分析结果的重现程度。稳定性(Stability)生物样品中药物的稳定性涉及储存条件、药物理化性质、基质、容器系统。Stability评价包括：样品收集与前处理、短期储存、长期储存、冻融、处理后稳定性。稳定性试验要求Stability考察条件应反映实际测定过程的实验条件。应包括Stockingsolution稳定性的考察冻融稳定性至少高、中、低三个浓度、三个冻融过程在真实实验条件下保存样品，室温化冻，至少保存24小时，第二、三次相同条件下至少保存12-24小时，在第三个circle时分析。□ 如果样品不稳定，应在-70°C下保存短期稳定性：样品化冻后室温4-24小时考察稳定性长期稳定性：应包括第一样品—>最后样品分析结束的全过程（三个浓度、足够样品）处理后稳定性分析过程〜〜〜一个方法经建立、验证、正常应用后进行分析。分析包括：标准溶液配制、分析法与过程建立、验证后方法应用与建立分析结果认可的标准。药物定量方法：LC、GC、生化免疫、同位素标示。验证要求：标准曲线至少6个点，包括LLOQ（标准曲线最低浓度）、ULOQ（最高浓度）Upperlimitofquantification精密度precision和准确度accuracy:三个浓度，每个浓度进样5次，测定与理论差<15%、LLOQ外<20%o三个浓度的分布要求:lowQCsample=3*LLOQmiddleQC=中间点highQC接近曲线最高点稳定性：2个浓度的三次冻融（每个2次？） 生物样品的室温稳定性、处理后的稳定性。分析数据的可接受标准标准曲线除LLOQ,CV在15%以内QCsample在分析过程中合理分布QCsample至少67%--> <15%最多33%--> >15%可接受每样品周期中QC样品至少5%中药指纹图谱方法验证评价标准 CSV图谱？参数：精密度、重现性、稳定性方法：相似度软件要求：相似度>0.9or0.95建立实验室的SOP标准操作规程SOP标准操作作业书SOP内容：原始记录保存试剂安全仪器 样品传递过程控制设备 样品标签质量控制 方法结果保证血清标本保存的温度和时间对荧光定量PCR检测HBVDNA结果的影响,Pv0.01,f=1.60.尸>0.05o3讨论HBVDNA定量检测具有重要的临床意义。①HBVDNA的定量阳性不仅可以辅助诊断血清HBsAg阳性的HBV的现症感染，而且由于该检查灵敏度高，不少HBsAg阴性的隐匿性HBV感染可据此发现。②与HBeAg比较HBVDNA的定量还可以更直接地了解病毒的复制水平，传染性的大小，据此作者可以更科学选择预防HBV传播的方法和协助选择治疗方法。③在抗病毒治疗过程中，通过对HBVDNA的定量的检测可以了解药物的疗效。④动态追踪急、慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA对于了解该病的自然史和发病机制等也具有重要意义。荧光定量PCR检测HBVDNA目前在国内开展较多，因为该方法具有敏感性高、线形范围广、检测较竞争PCR等方法相对方便等优点。采用本研究的试剂盒，其敏感度达5.0X10copies/ml，定量的线性范围为：1X10。copies/ml至5X10copies/mll2【，2h左右可以出结果。目前多数医院该项收费每份在150〜200元，因此每天标本来源有限，加之每次检测均需要设置3管对照管及4管阳性参控品，不可能每天检测。多数医院的办法是把标本收集、离心后放置在4°C的条件下，每周检测1次；又有研究表明体内游离的病毒颗粒的半衰期仅为1.2dI，这更提示作者需要评价血清标本在4C条件下保存7d对荧光定量PCRta测HBVDNA结果的影响。本研究显示当天检测与4C条件下保存7d后检测结果的符合率73.1%〜62.5%，其相关系数为0.93,配对f检验比较两组数据的均数的差异无显著性意义。即在4C条件下保存7d，HBV的降解量对检测结果的影响无统计学意义。因此，对于标本来源较少的单位，把标本置于4。。条件下保存每周检测1次是一种可行的方法，而不需严格规定2〜8〜C保存不超过72hI。最近Gessoni等的研究表明：4C条件下保存7d对HCVRNA的定量结果无影响。由于RNA比DNA更易于降解，因此本研究的结果是可以理解的。另外，需要注意：①体内、体外的情况是不一样的，尽管Nowak等研究表明体内游离的病毒颗粒的半衰期仅为1.2d【3】，这与体内存在的免疫清除，向体外排泄等因素有关。②对于标本来源更少的单位，需要超过1周的时间检测一次，在没有确实可靠的资料前，提倡先把血清提取置于一20〜C保存，直至检测(根据操作指南不应超过3个月)。如果由于条件的进一步改进，实验问的差异进一步减少，0.6对数单位作为允许误差范围不再合理时，本研究结果可能不再适用。③本研究也发现：尽管作者较严格地遵守PCR的操作规程及其他有关规定，两次实验问的符合率有待进一步提高。［当今分析仪器的自动系列集约化或条型码的应用，增加了系列化项目直接上机检测量，但是由于过去采血后血液自然凝固，分离血清时间长影响了分析仪的多种功能的充分发挥，为了迅速推进检测技术的快速化，往采血管中添加分离胶、促凝剂缩短了血液凝时间。分离胶促凝采血管的应用，是采血初级阶段重要质量控制，同时也制备了高品质的血清标本。原管直接上机检测，减少了血清杯、试管的用量，规范了检验科采血技术，减少了多种多样交叉感染机遇，从而保护了室内外环境。但是，血清分离胶促凝采血管在夷践应用中，出现了涉及到分离胶、促凝剂的基础理论及夷践中规范化操作值得注意的有关问题。必须从基础理论上去理解才能解决夷践中出现的问题，本文就此讨论如下。1973年美国PECTON公司、1982年日本积水化学工业的血清分离胶采血管投放市场，1993年中科院大速化物所和大速市临床检验中心，在国内首次研制出国产的血清分离胶，并受到卫生部临床检验中心的重视并参与规范化。1997年通过大速市科委鉴定，临床应用表明其性能己达到日本、美国的同类产品水平，其产品己投放国内外市埸。分离胶分离血清、血块的机理：血清分离胶由疏水有机化合物和硅石粉组成，具有触变性的粘液胶体，其结构中含有大量氢键，由于氢键的缔合作用形成网状结构，在离心力的作用下网状结构被破坏变为粘度低的流体，当离心力消失后又重新形成网状结构，这种性质被称为触变tt(thixotropy)。即在温度不变的情况下，对这种粘液胶体施加一定的机械力，可从高粘度的凝胶状态变为低粘度的溶胶状态，如果机械力消失又恢复原来高粘度的凝胶状态。由机械力作用产生的凝胶和溶胶互变现象首先由Freundlich和Petrifi命名。为什么由机械力的作用会产生凝胶与溶胶的互变现象呢？触变性是因为分离胶的结构内部含有大量氢^网状结构之故。具体的说：氢^不仅形成单一的共价^,在一定条件下它还与其它负电荷的分子间形成一个弱氢^,在常温下氢^比较转容易被切断引起再结合。硅石表面具有硅羟基(SiOH),形成SiO分子凝聚体(初级粒子)，在这种初级粒子间以氢键速结成^状结合粒子。这种链状硅石粒子与构成分离胶的疏水有机化合物的粒子间更进一步形成氢键而产生网状结构，构成具有触变的凝胶分子。分离胶比重维持在1.05，血清比重约1.02，血块比重约1.08,当分离胶与凝固后的血液在同一试管中离心时，由于对分离胶施加离心力而引起硅石凝聚体中的氢^网状结构被破坏变成链状结构，分离胶就成为粘度低的物质，比分离胶重的血块就移到管的底部，分离胶发生返转现象，形成管底部血块/分离胶/血清三层。当离心机停止转动失去离心力后，分离胶中硅石凝聚体的^状粒子间再次由氢键构成网状结构，恢复初始高粘度凝胶状态，在血清中血块间形成隔离血清分离胶促凝管和血浆分离胶抗凝管区别及用途：血清分离胶促凝管，主要应用于批量标本系列化项目检验，可原管直接上自动化分析仪。血浆分离胶抗凝采血管，主要应用于急诊生化、免疫项目系列化，用十化学分析仪检测。采血混匀后可立即离心获得血浆标本。如何正确使用血清分离胶促凝采血管制备高品质血清标本？应规范按下列图解操作。现今的分离胶采血管其原料为聚酯或聚丙烯。分离胶原料为聚烯烃、聚酯和丙烯。促凝剂为硅石粉、硅石炭素及蛇毒等喷徐于管壁.分离胶置于试管底部，注入血样待血液凝固后置离心机中离心，分离胶即在血清、血块之间形成隔离层。并使血清保持原状，无改变。此隔离层紧密地粘附在试管璧上，可在原状态下由自动分析仪直接吸取血清或冷藏保存，远途运输均不影响检测结果，也避免了纤维蛋白析出和溶血的影响。此外，自血样注入采血萱、血清分离、分析仪直取血清、血样保存，废弃物处理的全过程都在同一支管中进行，避免血样沾沾污操作者，防止血液中病毒的感染，减少了医疗废物，提高了工作效率。所以，血清分离胶的应用是医学检验的一项重要发展。真空静脉血液样本的采集是对传统采血方式的一次重大改进。由于是在全封闭系统下完成采血程序，因而从根本上排除了血液污染和交叉感染的可能性；并且因其结构简单，使用方便，因而易于普及和推广。但是，目前市场上真空采血管品牌众多，如产品质量欠佳可直接影响检测结果。在这里笔者对影响真空采血管质量的一些因素谈谈见解，不正之处请同行及用户指正。真空采血管的硅化质量用于试管内壁处理的硅油有很多种类，有溶于水和不溶于水的，有溶于有机溶液和不溶于有机溶液的，粘度有极易流动的液体和半固态状的液体。其间要选出适用于采血管内壁处理，具有良好的化学惰性和生理惰性的硅油绝非一件易事。硅化处理较好的试管，内壁应该是非常光滑的。通过简单的过水实验，就能辨别试管内壁处理的好坏。即将2毫升的水放入试管然后倒出，硅化处理好的试管内壁是绝无分散的小水珠残留在上面。那么可想而知，没有血细胞挂壁现象的真空管已经为分离出高品质的血清打下了良好的基础。2.EDTA-K2添加的均匀程度对血常规结果的影响由于玻璃管在安全性能上存有很大隐患，故目前使用特种塑料PET试管替代玻璃管成为一种趋势。由于PET试管有着良好的疏水性，很大程度上加大了真空管的生产难度。众所周知，当在PET试管内添加液体的EDTA-K2溶液时，由于PET试管的疏水性，一段时间后液态的EDTA-K2由于水分的部分流失，会在试管底部、管口或其他部位形成块状结晶，使其的溶解度大大的降低。大块的EDTA-K2结晶由于不能在短时间内充分与血液接触并溶于血标本，这样就容易产生血小板聚集，白细胞分类结果不理想，甚至出现血标本部分凝固等。我们知道，全血细胞分析所选用的EDTA-K2抗凝剂其最佳浓度为1.5〜2.2mg/1ml全血。如EDTA-K2浓度太低，抗凝强度不够，则出现血小板聚集现象；EDTA-K2浓度太高，尤其是有大块的EDTA-K2结晶存在时，使局部的血细胞处于高渗状态，此处细胞会出现暂时的收缩，这样会导致白细胞分类结果不理想等。为了避免因水分流失而形成的结晶现象，一个理想的血常规真空采血管，EDTA-K2晶体应该是非常细小均匀地分布在试管内壁。这样一旦血液进入试管，均匀分布的EDTA-K2就能迅速地跟血液充分混匀，从而杜绝了血常规结果因真空采血管的原因而出现异常的现象。分离胶与促凝剂的应用评价分离胶促凝管是医院真空管使用最普遍的一种管子，但要做好这种管子也不容易。评价分离胶促凝管品质好坏关键在以下几个方面：①用同一份血液标本，跟空白管做比对，某些离子含量是否会存在偏差。②将采集好含分离胶的血标本管子放在水温箱里，温度调到38〜39°C，待血标本充分凝固后，离心，然后检查血清中是否有油滴产生。由于油滴可对生化仪探针造成致命的堵塞，已有许多报道，关于这种现象的存在。③排除不正确的采血方法所造成的溶血因素，由于低劣的生产工艺，分离胶或促凝剂所残留的有机溶剂是破坏血液标本的元凶。这种破坏往往表现在标本有较多的溶血现象，在血清中间漂浮着分离胶颗粒。另外值得一提的是包括国外真空管知名公司在内都申明血凝管或促凝剂分离胶在采集血标本放置半个小时后离心，这样能很大程度上确保结果的准确性。防止真空采血管内的液体霉变用于血凝和血沉的枸橼酸钠抗凝剂试管，生产时对环境及用于溶解的水要求相当高。如果工艺和生产环境不当，或所用的溶解水纯度没达到要求等，那么生产出来的产品在一段时间后试管内的枸橼酸钠溶液就会有絮状物产生（长霉菌），从而造成检验结果失真。由于PET管有很好的疏水性，此类管子非特殊包装，建议在三个月内用完。除以上所述之外，肝素管和草酸钾/氟化钠管由于相对用量较少，在技术上也没有什么特殊之处，在这里就不一一叙述。另外值得一提的是真空管受海拔高度影响，故高海拔地区应选择高原型真空采血管。浅谈真空采血管相关知识2010-11-1115:44:551分类：工作I标签：I字号大中小订阅.真空采血管在国内外的历史发展以及现状：本世纪40年代初，真空采血技术被发明，它省略了抽拉针管和推血入试管等不必要的步骤，利用真空管中预先制造的真空自动吸血入管，很大程度上减少了溶血的可能。40年代美国BD公司率先推出商品真空型采血系统，其它医疗器械公司也先后推出自己的真空采血产品，至80年代，一种称为安全管盖（HEMOGARDTM）的全新管盖问世。安全管盖由套在真空管外的特殊塑料罩和新设计的橡胶管塞组成。二者结合在一起，减少了医疗工作者与管中内容物接触的可能，也减少了管盖拔出后内容物外溅的机会。塑料罩形成一个双井形凹陷结构，防止手指与管塞顶端及尾端残留血液的接触。这种带有安全管盖的真空采血管极大地减少了医疗工作者从采血到血样处理的全过程中沾染血样的可能，当年安全管盖荣获全美最佳工业设计大奖。真空采血系统由于其干净安全、简单可靠的特点已在世界范围内被广泛采用，并被NCCLS推荐，成为采血的标准器械。真空采血管90年代中期开始在我国部分医院使用。目前，大多数大中城市中型以上的医院已普遍接受了真空采血方式。作为临床血液采集和检测的新方式，真空采血器是对传统采血、储血方式的一场革命。真空采血系统主要由三部分构成：（1）双向无菌针头：一端连接真空管，另一端进行皮肤穿刺。由于双向无菌针头专为采血特别设计而成，与注射用针头不同，针尖斜面成15度，表面特殊润滑，更锋利、进针方便。一次静脉穿刺后，可以抽取单个或多个血样。（2）持针器：持针器内径13mm。配合规格统一的采血管使用，一端连接双向针头，另一端接真空管。持针器可以重复使用.（3）真空管：真空采血管标准直径13mm，长75mm或100mm，由高质量玻璃或塑料制成。虽然大小恒定，但由于管内真空度不同，可以抽取不同体积。管内含各种添加剂（抗凝剂和促凝剂等），无需自己配制、添加，减少了工序，方便、快捷；避免了自行配备添加剂的不准确，并且可以满足各种检验对血样的要求新型PET材质的真空采血管避免了玻璃试管破损后血液外溢的不安全。。真空采血管分类和制作原理目前医院使用的真空采血管主要有以下几个类别：无添加剂的干燥空管（白头管）：采血管内壁均匀涂有防止挂壁的药剂（硅酮），避免血细胞附壁，防止离心时细胞破碎，释放细胞内物质至细胞外，影响试验结果。它利用血液自然凝固的原理使血液凝固，等血清自然析出后，离心使用。主要用于血清生化（肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等）、电解质（血清钾、钠、氯、钙、磷等）、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学。促凝管（红头管）：采血管内壁均匀涂有防止挂壁的硅酮，同时添加了促凝剂，如凝血酶、蛇毒、硅石粉、硅碳素、纤维蛋白酶等可使血液在10〜30min凝固。促凝剂能激活纤维蛋白酶，使可溶性纤维蛋白变成不可溶性的纤维蛋白聚体，进而形成稳定的纤维蛋白凝块，如果想快点出结果时，可采用促凝管。一般用于急诊生化。含有分离胶及促凝剂的采血管（黄头管）：管壁经过硅化处理，并涂有促凝剂可加速血液的凝固，缩短检验时间。管内加有惰性分离胶，惰性分离胶是一种聚合高分子材料不溶于水，具有抗氧化，耐高温,抗低温，高稳定性之特性，比重约在1.04〜1.05。血清的比重在1.026〜1.031之间，红细胞的比重在1.092〜1.095之间。离心时，分离胶液化移到管中央，介于血清或血浆与血液有形成分之间,离心完毕后,固化形成屏障，使血清或血浆与细胞完全分离，保证了血清化学成分的稳定，冷藏下48h无明显改变。惰性分离胶管内可加有肝素，可达到快速分离血浆的目的，样本又可较长时间保存。分离胶与PET管具有很好的亲和性，确实起到隔离作用。高品质分离胶在离心后血清中不产生油滴，因此不会堵塞机器。主要用于血清生化（肝功、肾功、心肌酶、淀粉酶等）、电解质（血清钾、钠、氯、钙、磷等、甲状腺功能、药物检测、艾滋病检测、肿瘤标志物、血清免疫学。管内含有抗凝剂的采血管：1） 含有肝素钠或肝素锂的采血管（绿头管）：肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖，分子量15000，因有硫酸基团，带有强大的负电荷，具有加强抗凝血酶灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素是一种极佳的抗凝剂，对血液成分干扰少，不影响红细胞体积，不引起溶血，适用于做红细胞渗透脆性试验、血气、血浆渗透量、红细胞压积、血沉及普通生化测定。因肝素具有抗凝血酶的作用，不适于做血凝试验。过量的肝素会引起白细胞的聚集，不能用于白细胞计数，因其可使血片染色后背景呈淡蓝色，故不适于做白细胞分类。由于肝素不能使离体后的血小板离散，成为单个颗粒或细胞通过微孔，可造成血小板计数减低，白细胞计数及淋巴细胞计数偏高。商品肝素常含有磷酸盐，可使无机磷测定偏高。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则搁置过久血液又可凝固。2）含有乙二胺四乙酸（EDTA）以及其盐的采血管（紫头管）：乙二胺四乙酸是一种氨基多羧基酸，可以有效地鳌合血液中的钙离子，鳌合钙会将钙从反应点移走将阻止和终止内源性或外源性凝血过程，从而防止血液凝固，与其他抗凝剂比较而言，其对血球的凝集及血细胞的形态影响较小，并且可以抑制血小板的聚集，适用于一般血液学检验。EDTA溶液pH与盐类关系较大，低pH可使细胞膨胀。EDTA2K2可使红细胞体积轻度胀大，采血后短时间内平均血小板体积（MPV）非常不稳定,半小时后趋于稳定。EDTA2K2使钙、镁下降，同时使肌酸激酶（CK）、碱性磷酸酶（ALP）减低,因这些酶测定需要这些金属离子；EDTA2K3的最佳浓度是1.5mg/ml，如果血少,EDTA浓度增高,中性粒细胞会肿胀分叶消失，血小板会肿胀、崩解,产生正常血小板大小的碎片，使分析结果产生错误。EDTA由于螯合钙的作用强，使二磷酸腺苷（ADP）不能引起血小板聚集，另外EDTA能抑制或干涉纤维蛋白凝块形成时纤维蛋白单体聚合,不适用于血凝及血小板功能检查,亦不适用于钙、钾、钠及含氮物质测定。国际血液学标准化委员会（ICSH）推荐使用的抗凝剂是EDTA2K2,EDTA2Na2与EDTA2K2比较结果无明显变化,但其溶解度低，抗凝速度慢，不适合末梢血的抗凝。EDTA抗凝的末梢血也宜15min后测定，否则血小板有暂时聚集使血小板假性减少，白细胞假性升高,直方图异常。3） 含有柠檬酸钠抗凝剂浓度为3.2%（0.109mol/L）的采血管（蓝头管）：柠檬酸钠通过作用于血样中钙离子鳌合而起抗凝作用，大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝，它有助于V因子和伽因子的稳定。另外，用枸橼酸钠抗凝的血浆做活化部分凝血活酶时间（APTT）试验，其对肝素的敏感性远远高于草酸盐抗凝血浆，当APTT试验用于监控接受肝素治疗的患者时，这一点显得非常重要。枸橼酸钠6mg才能抗凝1ml血,碱性强，不适于血液化验,亦不适于做生化检测，枸橼酸钠对MPV及其他凝血因子影响极小，可用于血小板功能分析。血小板的聚集作用随血浆中枸橼酸钠的浓度降低而增高，因此在贫血患者应加入较正常人为多的抗凝剂。对于血液凝固试验来讲，如果血液比例过低,APTT时间会延长,凝血酶原时间（PT）结果亦会有显著改变。PT测定,3.8%的抗凝剂比3.2%的国际标准化比值（INR）值高，其差别变化一般在0.7〜2.7个INR单位之间。由于枸橼酸钠毒性小，也用于血液保存。同时枸橼酸钠在水中溶解慢，故只能配成水剂而不能用粉剂。抗凝剂与血比例为1：9时，主要用于纤溶系统（凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血酶时间、纤维蛋白原）。采血时应注意采足血量，以保证检验结果的准确性，采血后应立即颠倒混匀5-8次。4） 含有柠檬酸钠抗凝剂浓度为3.8%的采血管（黑头管）:其抗凝剂与血液的体积比为1：4，一般用于血沉检测，抗凝剂比例过于偏高时，血液被稀释，可使血沉加快。5）管内含有草酸钾/氟化钠（1份氟化钠3份草酸钾）（灰头管）：草酸钾是最常用的抗凝剂,优点是溶解度大，与血液混合后可迅速与血中的钙离子结合,形成不溶解的草酸钙，使血液不凝固。常配成10%溶液,0.1ml（10mg）可使5ml血液不凝固。常用于血液生化测定，但不适于钾、钙的测定，草酸钾还抑制乳酸脱氢酶（LDH）、ALP、淀粉酶（AMY）的活性。由于生成不溶性的草酸钙沉淀,红细胞会出现锯齿状，白细胞出现空泡,淋巴及单核会变形,不易做血片检查。草酸可影响血液中某些成分的活性及与钙形成的不溶性沉淀物可影响自动凝血仪测定时光电终点的观察，所以草酸钾很少用于血液学分析及血凝测定。而氟化钠是一种弱效抗凝剂，浓度达6〜10mg/ml血液才有抗凝作用,但它是血糖测定的优良保存剂，使用时应注意缓慢颠倒混匀，2mg/ml血液即能抑制糖分解。一般常同草酸钾合并使用，其比例为氟化钠1份,草酸钾3份，此混合物4mg可使1ml血液在2〜3d内不凝固和抑制糖分解。一般用于血糖检测，不能用于尿素酶法测定尿素，也不能用于检测碱性磷酸酶和淀粉酶的检测。因氟化物可激活尿素酶、淀粉酶。氟化钠用量大时可造成溶血。自动化仪器的大量使用及血液的保存对血样原始性状稳定性提出了更高的要求,使真空采血技术突破了仅仅只为安全的要求，而准确性、标本的原始性状、维持时间及管机配合、试管强度等性能指标都不能忽视，如何正确使用真空采血管以及真空采血管本身的优劣都将影响标本原始性状及检测的准确性：一、 真空采血管的正确使用：1、将瓶塞穿刺针（不要将乳胶护套拔下）从采血管中心垂直刺入真空管内，管中预设的真空将使所需要的血液流入管中，应按管壁上的刻度值控制采血量；2、 当第一管采完后，拔出瓶塞穿刺针再刺入另一真空管，如此重复操作，可实现一针多管采血；3、 保证血液与管内附加剂正确混合，采样后立即轻轻倒置真空管五至八次。当最后一管采样完毕，将针头抽离静脉，管中的负压可将管中残存的约0.4ml的血吸入管内。4、 多管采血顺序：先抽普通（血清管），再抽速凝管，最后抽抗凝管。二、 真空采血管本身的优劣（一）、相关材料的性能指标空采血管的材质:现在采血管多为玻璃材料，普通玻璃的pH相差甚远,溶血的可能性大大增加,而拉管工艺制作的玻璃试管线性沟密布，深浅粗细无常导致细胞的挂壁，相比较中性玻璃（药用玻璃）的优势很明显。中性玻璃具有耐压，溶出物少，分子排列紧密,拉伸时沟槽少等优点，但仍有表面负电荷过强,pb2+、Zn2+、K+、Fe2+的相对溶出等缺点。这些都可能改变血液标本的原始性状，因此玻璃试管在使用前应进行无菌和内壁处理。传统的内壁处理就是硅化，即将硅油分散在乙醚与乙醇中，涂覆管壁晾干或烘烤即成。由于硅油是一种惰性极强的混合物，不可能与玻璃表面发生任何性质的化学作用,只是粘附在试管内壁，牢度较低。另外硅油对预先加入的抗凝剂的有机酸根具有包覆作用，使试剂的络合能力丧失，造成凝血。目前最好的处理方法为钻60照射,去离子水冲洗，确保无菌、光滑、无异物,有效防止溶血。对无添加剂的采血管内壁涂有硅酮，避免血细胞附壁,防止离心时细胞破碎。但从环保和安全性去考虑，塑料材料的真空采血管,质轻便于运输，破损率小，用后可直接高压灭菌或焚烧销毁，将会是真空采血管材质选择的一个很大的趋势。密封胶塞:密封胶塞的质量直接影响到试管的真空性能及血液样本的原始状态，推荐使用丁基橡胶而不用天然橡胶。天然橡胶填料外渗严重，是一种可致溶血的材料，许多有机填料和助剂（包括石蜡油，硅油，柔软剂，着色剂等）在真空状态下会沿玻璃管壁往下爬，这类物质尤其影响真空干燥的肝素类物质的水溶性而导致凝血。另外其气透性及水透性也不符合真空管的技术要求，真空丢失严重，管塞结合部可见塞屑粘壁严重。而丁基橡胶具有良好的塞封性能，溶出物大大减少,使得采血管即便是在101.3kPa的负压时仍能在24个月内保持真空恒定。真空恒定使采血对象即使有血压及血液粘度的差别,以及采血环境温度的变化仍能保持采血量的相对准确，实际采血量误差可控制在±5%以内。误差的来源主要是血液粘度的变化和操作偶然误差，另一方面则是试管口径的细微差别。现代采血管多采用双层管帽设计,在内层涂有润滑剂的橡胶软塞外面套有纹面塑料管盖，使开启极为轻松，其侧滑式的开启方式可防止血液的飞溅。胶塞脊形的设计，使盖更加牢固，盖子顶部凹下部分可保证防止接触血液标本,减少对操作人员的血源污染。采用国际通用的头盖颜色标记采血管用途,鲜明夺目，极易分辨，避免采血时用错添加剂以及送检样本与检测项目不符。3、试管的直径:国标试管的直径是11.6〜12.0mm，而现代医学检验中的自动生化分析仪以及血液分析仪，大多为美国、日本产品,其样品架内卡直径为13mm，国标管显然过小。直接上机后无法固定而程度不同的倾斜,偏离探针运作时的轴心,探针被击伤的可能性大大增加。而真空采血管多采用13（16）mmx75mm、13（16）mmx100mm的规格，适用于日立、贝克曼2库尔特、东芝、奥林巴斯、岛津、雅培、拜尔、罗氏、Dade2Bering、法玛西亚等仪器直接上机使用。4、双向采血针以及持针器:即静脉穿刺针和管塞针，中间软管连接,形成采血系统，一次进针，多管采血。针头切割边缘，长度及角度采用电脑设计，专门应用于静脉穿刺,切割边缘极为平滑，新型硅胶外膜，使患者的不适及采样后遗留的疼痛感大大减轻。针管内表面极度光滑,管壁最薄,采血速度快,细胞破损少。管塞针的止血护套在脱离胶塞时能永久封住针头，护套回弹毋需时间积累，效率极高。护套防止疲劳时限应超过24个月，该时限内连续冲击30次，回弹复位率应达100%。持针器的设计多为静脉穿刺和管塞穿刺针双向直通式，采样时只需换双向针头，可反复使用。BD公司的pronto持针器。采用卡环设计，采样后只需轻按绿色卡环，即可卸下双向采血针，快速简便,与其配套的设计还有废针丢弃盒,避免采血者被污染针头所伤。北京创格公司的上插式（直角式）持针器，回血清晰,采血量易观察不易穿透静脉。奥地利greiner的偏心嘴管的持针架Holdex刺入静脉角度好，使用方便。（二）、添加剂的正确使用由于血液分析的多样性,添加剂包括多种成分，如抗凝剂、促凝剂、缓冲剂、保护剂、分离胶等。其品种、性能、浓度直接影响血样的性状和检测结果。真空采血技术则在品种、浓度方面做到规范一致，并能长期维持其有效性，使添加剂对检测结果的影响降到最小。真空采血管制作和使用过程中容易出现的问题虽然真空采血管由于其操作简便、干净安全、准确可靠，正为各医院普遍应用。但在临床使用过程中，时有各种问题发生，影响了标本的顺利采集。以下几点是真空采血管使用中应注意的几个问题：取血时患者应松弛，环境温暖,防止静脉挛缩。束膊时间不可过长，禁止拍打手臂，否则可造成局部血液浓缩或激活凝血系统。握拳2min后可使钾的血清浓度增加1.0〜1.5mmol/L。血液采集应一针见血，以防止组织损伤，外源性凝血因子进入试管，影响试验结果。样本采集血量要充足，真空的存在易使血球破裂，若使用不足血样，采血后应开启瓶塞片刻。血液与抗凝剂的比例必须精确，抗凝剂在血标本中的绝对含量可改变血浆中钙离子浓度进而影响实验结果。钙的绝对浓度越高,PT、APTT凝固时间越短。使用含促凝剂或分离胶的采血管时，一定要等血液凝固后再离心，否则血清中易出现凝块而造成仪器堵孔。血清管（红）一般要等0.5〜1h,含促凝剂的要等10〜30min，肝素管（绿）混匀后充分抗凝后即可离心分离血浆，分离胶管（黄）5〜10min后离心。推荐的采血顺序为凝血管（血清管）一枸橼酸钠管一肝素或EDTA管一草酸钾2氟化钠管f血沉管。主要原因是第一管内往往含有组织液，易造成凝血，不适于做血凝测定。采血完毕后，先将最后一支试管抽离持针器，然后将针头由静脉拔出，如有漏血,除针头安装不严外，多见于止血保护套剥下或止血护套回弹过慢或不能回弹到位所致。6、 由于真空管的负压相对较大，采血初始，血液流入管底速度快，红细胞相互撞击可致破裂，临床偶见溶血。对此在采集血标本时，倾斜双向采血针采血管侧针头，使其靠近采血管侧壁，血液沿管壁缓缓流下，避免红细胞直接撞击造成破裂，形成溶血。7、 由于双向采血针采血管端乳胶护套松动或针头刺出乳胶护套，至使双向采血针密封不严。静脉穿刺时，血液沿双向采血针采血管端漏出。对此在采血前检查并安紧乳胶护套，遇有针头刺出则重新套好针头，以保持其密闭性。8、 由于穿刺针头贴于血管壁或采血管内无负压，而形成的血液流入不畅现象，可以在保证静脉穿刺成功的前提下，调节针头方向至血液流入采血管，若无效则更换采血管。9、 由于采血管内负压不足，而导致的采血量不足，可以将注射器针头自采血管胶塞处刺入，抽吸采血管内空气使之形成负压至采足血标本。原有血容量较少时也可直接更换采血管。真空采血管的好坏对分析过程中起到如何重要的作用预置真空度，严格控制采血量：多数情况下，静脉血样的质量取决于血液和抗凝剂的比例，但是使用针头-注射器-试管采血，抗凝剂的配制、添加、采血的多少都很难严格控制，所以血液和抗凝剂的比例也很难准确。血液和抗凝剂的比例过高或过低都会影响血样的质量。血液比例过高时，由于抗凝剂相对不足，血浆中出现微凝血块的可能性增加。微凝血块可能阻塞检验仪器，影响一些检验指