遗传性疾病的分子诊断12am

DNAmRNA蛋白质转录反转录

翻译

核酸的分子杂交

基因结构异常基因表达异常PCR

DNA测序

Nothern-blot

实时荧光定量PCR

反转录PCR

蛋白质芯片

ELISA

蛋白组织化学染色Western-blot基因芯片

基因诊断的技术和方法遗传性疾病分子诊断严永敏基础医学与医学技术学院遗传性疾病诊断策略

1.点突变的诊断

方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特异性扩增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技术进行诊断；对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析（HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等方法。一、限制性内切酶法（RE法）导致某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入，

导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析二、ASO探针杂交受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交主要适用于检测已知点突变ASO1ASO2NormalHeteroHomoPCR-SSCP2.片段性突变的检测

片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用Southern印迹技术和多重PCR技术。杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断

多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）P1除外显子1外其余均缺失；P2外显子8－19有小的缺失；P3外显子44-50缺失；P4外显子45－52有小的缺失；B1空白对照；C1、C2正常对照。遗传性疾病诊断策略

DNA多态（DNAPolymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法。

基因连锁分析常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：

称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单核苷酸多态性（SNP）DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。1Southernblot--RFLP诊断(PKU)间接基因诊断PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。间接基因诊断数目变异串联重复

variablenumbertandemrepeats,VNTR重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR。散在分布于染色体上。重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。

重复单位2~6bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA，又称短串联重复序列(STR)。VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，电泳后的检测结果

大小PCR-VNTR检测PCR-VNTR成年型多囊肾病的诊断例：成年型多囊肾病——APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKD——Gene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKDGene与α珠蛋白基因3`端附近的一段小卫星DNA序列（3`HVR）紧密连锁，因此，可以通过VNTR连锁分析进行诊断。间接基因诊断以3`HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行SouthernBlot

基因组DNAPvuII酶切DNA片段变性转膜探针变性杂交结果分析间接基因诊断1212345

5.7kb3.4kb2.3kb

间接基因诊断结果分析患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。间接基因诊断单核苷酸多态SingleNucleiotidePolymorphism，SNPSNP：发生在基因组中的单