基因工程的基本操作程序

第二节

基因工程的基本操作程序获取目的基因构建表达载体导入受体细胞目的基因检测与鉴定第一步第二步第三步第四步基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取（一）从基因文库中获取目的基因1.基因组文库将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。

受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。2.部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。

胰岛B细胞的DNA上含有全部的基因胰岛B细胞的mRNA上含有部分的基因呼吸酶基因胰高血糖素基因

胰岛素基因

抗体基因……ATP酶基因

呼吸酶基因

胰岛素基因

ATP酶基因

转录基因的选择性表达

胰岛A细胞的DNA上含有全部的基因胰岛A细胞的mRNA上含有部分的基因呼吸酶基因胰高血糖素基因

胰岛素基因

抗体基因……ATP酶基因

呼吸酶基因

胰高血糖素基因

ATP酶基因

转录基因的选择性表达

浆细胞的DNA上含有全部的基因抗体细胞的mRNA上含有部分的基因呼吸酶基因胰高血糖素基因

胰岛素基因

抗体基因

……ATP酶基因

呼吸酶基因

抗体基因

ATP酶基因

转录基因的选择性表达3.基因文库的构建（1）基因组文库的构建提取某生物全部DNA用适当限制酶切割许多DNA片段与载体连接导入受体菌群该生物基因组文库（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）（2）cDNA文库的构建——mRNA反转录形成逆转录酶RNA酶单链DNADNA聚合酶双链DNA与载体连接导入受体菌群该生物cDNA文库杂交双链cDNA双链DNAmRNA（二）利用PCR技术扩增目的基因1.原理PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）,它是利用DNA双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。2.过程高温变性（90~95℃）低温退火（55~60℃）中温延伸（70~75℃）双链DNA在高温条件下解链为单链DNA，因此整个过程不需要解旋酶。多次重复3.特点：指数形式扩增DNA在体内复制：当细胞每经历一个周期时，DNA在细胞核里复制一次，而细胞周期大约是19~30h，所以DNA在体内复制很慢；PCR是DNA在体外复制，每一轮循环大约1.5~2min就可以复制一次，所以短时间就可以得到大量DNA。其次，DNA体内复制是在正常温度下进行的（37℃），需要解旋酶；而PCR是在剧烈温度（94℃）下进行的，不需要解旋酶。（三）通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪蛋白质的氨基酸顺序mRAN核苷酸序列基因DNA的核苷酸序列目的基因推测推测合成当基因比较小、核苷酸序列已知时，可采用化学合成的方法。二、基因表达载体的构建

用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA

使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。1.目的基因2.启动子RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。（一）构建目的（二）构建零件及其作用3.终止子一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。4.标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。（四）启动子、终止子与起始密码子、终止密码子的区别启动子终止子起始密码子终止密码子本质作用DNAmRNA上三个相邻的碱基开始或终止转录开始或终止翻译获取目的基因的方法有3种：1.可以从（）中获取；2.可以通过PCR反应，PCR的中文名叫（）。PCR需要（）酶和引物；3.目的基因还可以通过人工化学合成，前提是该基因（）且（）已知。基因文库多聚酶链式反应Taq比较小碱基序列三、将目的基因导入受体细胞

将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。

基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法，因受体细胞的不同而不同。（1）农杆菌转化法①适用范围：

易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力②原理：

Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。（一）导入植物细胞③转化过程:Ti质粒目的基因构建表达载体导入植物细胞插入植物细胞染色DNA表达新性状转入农杆菌（2）基因枪法（3）花粉通道法适用于单子叶植物我国科学家独创的方法，适用于被子植物显微注射技术含目的基因的表达载体动物的受精卵含目的基因的受精卵早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物显微注射分裂分化移植发育为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？（二）导入动物细胞2.优点繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、

价格低廉。3.常用受体细胞大肠杆菌（E.coli）1.过程（1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细

菌易于接受外源DNA分子。（2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。Ca2+处理法（三）导入微生物细胞抗生素可以杀死细菌，如氨苄青霉素。而“抗生素抗性基因”是指该基因表达出来的性状是对某种抗生素（如氨苄青霉素）有抗性。如果某细菌拥有这个基因它就可以生活在含有氨苄青霉素的培养液中。4.标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。下列关于基因表达载体的叙述不正确的是A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，有起始翻译的作用B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选D．基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别A质粒目的基因限制酶DNA连接酶重组DNA四、目的基因的检测与鉴定

目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。生物大分子包括DNA、RNA和蛋白质知识延伸——DNA分子杂交技术123432人黑猩猩DNA分子杂交原理：DNA分子杂交是基因诊断最基本的方法之一。其基本原理是：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用一段已知基因的核苷酸序列作为探针，与被测基因进行接触，若两者的碱基完全配对成双链，则表明被测基因中含有已知的基因序列。探针：是一小段单链DNA，可以与其同源的的核酸（DNA或RNA都可以）发生互补。探针一般用放射性同位素（如32P）或者荧光显色基团标记，使其可以被仪器检测到。将探针与样品DNA混合时，如果样品中含有探针所带有的目的基因片段，则探针就可以与其通过氢键互补，而不含有与探针互补序列的核酸则不能与探针杂交，无法检测到放射性或荧光。DNA探针杂交的基本方法是：从受体细胞中提取全部的DNA，通过加热或者化学方法使双链DNA变性成单链DNA，并将单链DNA放在特殊的胶膜上与相对应结构的探针进行杂交（探针一般都用同位素或者某种颜色的荧光标记），可进行观察。受体细胞甲受体细胞乙与探针成功杂交互补受体细胞甲目的基因12342.检测目的基因是否转录出了mRNA提取受体生物的mRNA用同位素标记的目的基因片段杂交显出杂交带（表明目的基因已转录出了mRNA）

检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。3.检测目的基因是否翻译出蛋白质抗原—抗体杂交技术提取受体生物的蛋白质与相应抗体杂交显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）（二）个体水平例：用棉铃饲喂棉铃虫虫吃后不出现中毒症状未摄入目的基因或摄入目的基因未表达.虫吃后

中毒死亡摄入了抗虫基因并得到表达。与核心DNA水平、mRNA水平、蛋白质水平和个体水平9．1976年，美国科学家首次将人的生长抑制素释放因子基因转入大肠杆菌，并获得表达，这是人类第一次获得的转基因生物.此文中的“表达”是指该基因在大肠杆菌内A．能进行自我复制B．能进行转录C．能控制合成人的生长抑制素释放因子D．能合成人的生长激素8．运用生物学原理，可培育出各种符合人类需要的生物品种.下列叙述错误的是A．培育青霉素高产菌株是利用基因突变的原理B．培育无子西瓜是利用基因重组的原理C．培育八倍体小黑麦利用的是染色体变异的原理．D．培育高产抗病的小麦利用的是基因重组的原理2.（08广东卷·8）改良缺乏某种抗病性的水稻品种，不宜采用的方法是A．诱变育种 B．单倍体育种 C．基因工程育种 D．杂交育种解析：本题考查育种的几个基本方法的特点。正确把握“缺乏某种抗病性的水稻”及其原因是解答本题的关键。可通过诱变育种或基因工程育种的方法使水稻获得抗性基因，可通过杂交育种培育抗病性水稻。单倍体育种过程，只是让单倍体原有的染色体及其上面的基因加倍，无抗病基因并不能产生相应的变异。7.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因