细菌内毒素的简介

细菌内毒素检查法在药品和医疗器械检查中的应用细菌内毒素检查本讲座共分三部分一、基础部分二、标准部分三、实验操作部分一、基础部分1.前言

防止输注用药品及器械的热原污染，是临床上十分重要的。半个多世纪以来，热原检查法对保证注射用药品安全发挥了重要作用。但随着制药工业的发展，该方法已不完全适合许多品种的热原检查。为此，人们研究了一种替代热原检查法的方法，这就是我们今天正在研究和扩大应用的细菌内毒素检查法。细菌内毒素检查是输注药品及器械质量控制中的一项重要指标。1.1细菌内毒素检查法1885年美国的W.H.Howell发表了一篇有关鲎血的化学组成和凝集方面的研究成果，这可以说是鲎试验历史的开端。1956年，美国动物学家F.Bang发表论文《鲎的一种细菌性疾病》，阐明了细菌内毒素使鲎血凝固的现象。1964年F.Bang和J.Levin提出了鲎血凝集的初步机理，1968年正式建立鲎试验（Limulustest,LT)方法。1980年USP20版；1987年欧洲药典、1989年英国药典1989增补本、1988年日本药典第11增补本、1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。1.2细菌内毒素在我国的发展在我国，1975年开始鲎试剂的研制，1979年开始将其用于放射性药品的细菌内毒素检查方法研究，1983年开始用于输液制剂热原检查的协作研究。1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，允许4种药品采用细菌内毒素检查法作为热原检查的初试方法；1993年中国药典1990年版第二增补本开始收载细菌内毒素检查法。1995年版中国药典规定13个品种进行细菌内毒素检查法。2000年版药典规定60个品种进行细菌内毒素检查法。2005年版药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法。2有关术语及相关内容2.1热原反应—病人在静脉输注药剂后可能发生的发热、冷感、寒颤、恶心、呕吐、头痛、腰及四肢关节痛、肤色灰白、白细胞下降、血管通透性增强、昏迷、休克、死亡等一系列症状称为热原反应。2.2热原—所有能引起热原反应的物质称为热原。药品中的热原主要是细菌内毒素。一般可以认为：细菌内毒素是热原，但热原不等于细菌内毒素。2.3细菌内毒素检查法—2005年版中国药典定义为：系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。2.4鲎试剂—我国生产的鲎试剂系鲎科动物东方鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，用于细菌内毒素检查。根据检查方法分为凝胶法鲎试剂和定量法鲎试剂；根据鲎试剂与内毒素反应的专一程度分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。特异性鲎试剂是专一对内毒素反应的鲎试剂。鲎试剂灵敏度用符号λ表示，单位用EU/ml表示。2.5鲎–鲎是一种栖生于海洋的低等无脊椎动物，出现在古代泥盆纪，现存于世的有三属四种，常见的有两种，美洲鲎和东方鲎2.6细菌内毒素—是革兰氏阴性菌的细胞外壁层上的特有结构，即脂多糖，具有广泛的生物活性，以致热居首。其量值以国际单位（IU)或内毒素单位（EU)表示，现规定1IU=1EU。2.7细菌外毒素与细菌内毒素细菌外毒素是一种由活菌合成并释放出来，对热敏感的蛋白质。细菌内毒素是一种对热抵抗，且只有当菌体死亡裂解或人工破碎后方可释放来。外毒素与内毒素的主要区别区别要点外毒素内毒素来源G+、部分G-G-存在不位胞浆内合成分泌至菌体外细胞壁成分化学成分蛋白质脂多糖稳定性不稳定，60-80℃破坏160-240℃破坏毒性作用强，有选择性弱抗原性强，可制成类毒素弱举例肉毒毒素，白喉外毒素大肠杆菌内毒素内毒素的主要生物活性：1发热反应2白细胞反应3代谢性酸中毒4感染性休克5弥漫性血管内凝血（DIC)2.8细菌内毒素标准品细菌内毒素标准品分为细菌内毒素国际标准品、国家标准品和工作标准品。在我国，细菌内毒素国家标准品系自大肠杆菌提取精制得到的内毒素。

1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品（94/580，10000IU），规定1IU=IEU。981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品，共生产8批。细菌内毒素工作品分为冻干品和液体两种剂型，均可用于鲎试剂复核、干扰试验和实验中的阳性对照。本品为一次性使用。2.9细菌内毒素检查用水2005年版中国药典规定细菌内毒素检查用水系指与灵敏度0.015EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24h不产生凝集反应的灭菌注射用水。3细菌内毒素的化学结构、量值和限值3.1化学结构细菌内毒素的本质是脂多糖（LPS)，主要有两部分组成：多糖和类脂A。多糖部分又可进一步分为O-特异性多糖链、核心寡聚糖。O-特异性脂多糖一般由3-6个单糖通过糖苷键相联形成低聚糖单位聚集而成，是LPS分子中最易变异的成分。核心寡聚糖分为内核和外核。外核由数种己糖组成，内核含有庚糖特殊的酮糖，这部分结构对不同菌株的LPS基本相似。类脂A是LPS的毒性及生物活性中心。典型的类脂A含有一个以β1’，6-糖苷键相连的D-氨基葡萄糖双糖组成的基本骨架，双糖骨架的游离羟基及氨基可携带长链脂肪酸和磷酸基团。不同种属细菌合成的类脂A的分子组成及其骨架上的取代基团性质有差异。3.2细菌内毒素的量值1996年WHO建立第二批国际内毒素标准品(94/580，10000IU),规定1IU=1EU。我国国家标准品981是用IS2为基准标定的我国第6批国家标准品。每支含内毒素9000EU。3.3细菌内毒素的限值供试品细菌内毒素限值按一下公式确定L=K/M，式中L为供试品内毒素限值，以EU/ml、EU/mg、EU/U表示。K为按给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，以EU/kg表示，注射剂K=5EU/kg/hr。M为人用最大剂量，以ml/kg/hr,mg/kg/hr,U/kg/hr表示，中国人均体重按60kg计算。

4中国药典2005年版细菌内毒素检查法的修订内容

中国药典2005年版较中国药典2000年版有重大修订，主要修订内容如下：4.1.定义改变：2005年版药典定义细菌内毒素检查法为利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4中国药典2005年版细菌内毒素检查法的修订内容2000年版定义为：利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。4.2.把中国药典2000年版的细菌内毒素检查法应用指导原则，合并入附录ⅪE细菌内毒素检查法。4.3.明确了细菌内毒素检查有两种方法：凝胶法和光度测定法，供试品检测时，可用其中任意一种方法进行试验，只有当测定结果有争议时，以凝胶法结果为准。4.4细菌内毒素检查用水的要求提高，内毒素含量降到了0.015EU/ml，光度测定法用细菌内毒素检查用水的内毒素含量小于0.005EU/ml。4.5增加了供试品溶液的制备这一项，明确了供试品溶液的PH值在6.0~8.0范围内，配制酸、碱及缓冲盐的容器应去除内毒素，水用细菌内毒素检查用水。4.6鲎试剂灵敏度的定义有所改变2000年版的定义是：在本检查法规定的条件下能检测出内毒素标准溶液或供试品溶液中的最低内毒素浓度；2005年版的定义是：在本检查法规定的条件下使鲎试剂产生凝聚的最低内毒素浓度4.7.把原来的凝胶法细分为凝胶限量试验和凝胶半定量试验。4.8.凝胶限量试验中，阴性对照和阳性对照的平行管数都增加为2支。4.9.增加了凝胶半定量试验，通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素的含量。4.10.较详细讲述了光度测定法的方法。二、标准部分2.1细菌内毒素检查法（中国药典2005年版）2.2医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法GB/T14233.2-932.3生物材料和医疗器材的细菌内毒素检查法（卫生部药政局1997年药发[1997]第81号）医用输液、输血、注射器细菌内毒素检查法

生物材料和医疗器械的细菌内毒素检查法

与中国药典2005年版的比较法规项目医用输液、输血注射器BET生物材料和医疗器械BET中国药典2005年BET除热原程序玻璃器具180℃干烤2h获250℃30min,塑料器具30%双氧水4h，无热原水冲洗后60℃烘干。250℃至少30Min,或180℃至少2h,也可用其他适宜的方法。250℃至少1h也可用其他适宜的方法，并应确证不干扰BET的检查鲎试剂灵敏度复核检测能出现阳性结果阴性结果的4个连续2倍等比稀释液，平行4管，37±1℃保温60±2min,最高浓度的4管均为阳性，最低浓度的4管均为阴性。按公式计算当s＜0.365时按λ=log-1(Σx/4)计算鲎试剂的灵敏度；s≥0.365时，测定无效。检测2.0λ、λ0.5λ、0.25λ的内毒素平行4组，同时做4管阴性，最高浓度的4管均为阳性，最低浓度的4管均为阴性。S标准差X4个连续内毒素稀释液最低阳性结果浓度的对数值。检测2.0λ、λ、0.5λ、0.25λ的内毒素平行4组，同时做2管阴性，最大浓度2.0λ的4管均为阳性，最低浓度0.25λ的4管均为阴性NC均为阴性λc=lg-1(Σx/4)λ在0.5λ~2.0λ间有效干扰试验未涉及比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行4组，结果Es、Et均应0.5λ~2.0λ之间，样品的稀释不大于MVD,3个批号比较鲎试剂在水中和样品中的灵敏度，各平行4组，结果Es、Et均应0.5λ~2.0λ之间，样品的稀释不大于MVD,3个批号2个以上厂家的鲎试剂检查法供试品至少3个浸提介质：内毒素含量＜0.05EU/ml输液器10ml,输血器15ml,反复荡洗5次后两端密闭，37℃2h后合并2支NC,2支PC,2支供试品。样品稀释到MVD，1支NC,1支PC,1支PPC2支供试品。样品稀释到MVD，2支NC,2支PC,2支PPC2支供试品。结果判断PC为阳性NC为阴性样品均为阴性，合格PC为阳性PPC为阳性NC为阴性样品均为阴性，合格PC为阳性PPC为阳性NC为阴性样品均为阴性，合格其他鲎试剂灵敏度0.25EU/ml供试品细菌内毒素限量不超过0.5EU/ml样品溶液不稀释，当结果出现阳性时，1→2稀释，4支，1支阳，无热原注射用水0.05EU/ml为浸提介质细菌内毒素检查用水内毒素含量小于0.015EU/ml三、试验操作1.简述1.1鲎试剂灵敏度复核项的目的不仅是考察鲎试剂灵敏度和细菌内毒素工作标准品的效价是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确和试验条件是否符合规定。因此每个实验室再将一批新的鲎试剂用于试验前应进行鲎试剂灵敏度复核项试验。1.2干扰试验项用于建立新品种细菌内毒素检查方法以及供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制作用。1.3供试品检查时，阴性对照、阳性对照、和供试品阳性对照必须同时进行，否则结果无效。2试验材料及用具天平、电热干燥箱（180~300℃）、恒温水浴箱（37±1℃）、漩涡混合器、鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号）、细菌内毒素工作品、细菌内毒素检查用水；其他试验用具如移液枪、封口膜、一次性安剖等。3.凝胶实验技术3.1凝胶法的实验程序1试验准备：试剂、仪器及用具等2确定药品的细菌内毒素限值L3选择鲎试剂的灵敏度λ4计算供试品的最大有效稀释倍数或最小有效浓度5鲎试剂灵敏度复核6药品与鲎试剂相容性的初筛试验7供试品干扰试验8干扰试验的验证9供试品日常的内毒素限量检查3.2.鲎试剂灵敏度复核3.2.1内毒素标准溶液的制备取细菌内毒素国家标准品或国家工作标准品一支，用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，75%酒精棉球擦拭后开启，防止玻璃屑落入瓶内。按药典操作。例如使用细菌内毒素工作标准品（150601-2005-10，100EU/ml)时的方法如下：①复溶：准确吸取细菌内毒素检查用水1ml假如瓶内，用封口膜将瓶口封严，置漩涡混合器上混合15分钟，即为100EU/ml。②稀释：取0.2ml内毒素标准溶液加入1.8ml细菌内毒素检查用水为1→10稀释液，即为10EU/ml内毒素标准溶液。取0.2ml1→10稀释液，加入1.8ml细菌内毒素检查用水1→100稀释液即为1EU/ml内毒素标准溶液。以后依次成倍稀释分别为0.5EU/ml，0.25EU/ml，0.125EU/ml，0.0625EU/ml，0.03125EU/ml。在上述稀释过程中，每稀释一步，均需在漩涡混合器上混合30秒钟。3.2.3待复核鲎试剂按药典准备例如：复核湛江博康海洋生物有限公司TAL（0511090,0.125EU/