第16章 反义核酸类药物

反义药物主要内容一、反义核酸与反义技术反义核酸和反义技术概念反义核酸的基本原理反义核酸的种类反义核酸与反义技术的应用反义核酸和反义技术反义核酸(antisensenucleicacid)

是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列

它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点反义核酸技术（antisensenucleicacidstechnology)

是根据核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的一类核酸研究新技术

包括反义RNA(asRNA)、反义DNA(asDNA)、核酶(Rz)反义核酸的基本原理绝大多数DNA由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸不同排列顺序编码在DNA链上，基因组形成单顺反子结构在DNA双链上被转录为RNA的链为正义链，与其相对应的链为反义链精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由7到30个核苷酸组成，将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，干扰特定基因表达利用这一原理可以在基因位点、前体mRNA、mRNA及蛋白水平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡反义基因治疗

DNADNA

RNARNA

反义RNA

阻断表达利用人工合成的反义RNA或DNA导入靶细胞，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为mRNA或阻断翻译相应蛋白反义技术的两种技术路线将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的mRNA，从而阻断目标基因的表达体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性地与目标mRNA作用以第二种为主来介绍反义核酸的种类反义RNA：一类能与特异mRNA互补的小分子质量的、可扩散的DNA转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达反义DNA：人工合成一小段反义寡核苷酸，与DNA或mRNA序列互补结合，封闭靶基因表达（ASODN）

理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻断mRNA拼接、转录、翻译，下调特定基因表达反义RNA的作用机制作用于外显子和内含子的连接区，阻止mRNA前体的剪接反义RNA与DNA结合时能阻止转录因子与DNA的结合，从而阻止特定基因的转录互补于特定mRNA的非编码区，如SD序列或核糖体结合位点及其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译互补于特定mRNA的编码区，抑制翻译或激活RNaseH使mRNA易被核酸酶降解作用于靶mRNA的5’端，阻止帽子结构形成，影响mRNA的成熟作用于PoIyA形成位点，阻止靶mRNA成熟及向胞浆内的转运反义RNA的作用机制DNApreRNARNAProteinm7G5'pppAA…AArRNA反义RNA的获得途径化学合成法：利用核酸合成仪直接合成反义RNA体外转录法：利用带有噬菌体SP6或T7等启动子序列的质粒，将特异基因的DNA片段反向插入其多克隆位点中，在RNA聚合酶的作用下体外合成特异性反义RNA细胞内转录法：利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义RNA表达载体(病毒表达载体或质粒表达载体)，然后转染细胞并使之在细胞中稳定表达反义RNA反义RNA的临床作用抗病毒：将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义RNA表达载体再将重组体导入真核细胞(病毒宿主细胞)中表达特异性反义RNA从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒）抗肿瘤：设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义RNA以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的ANTISENSETECHNOLOGIESGENOMICSBASEDDRUGDISCOVERYPHARMACEUTICALSMOLECULARDIAGNOSTICSGENETHERAPYDRUGDELIVERYSYSTEMSRelationofantisensetechnologiestoothersegmentsofbiopharmaceuticalindustry反义技术与反义核酸的应用治疗方法

根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA

相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位

点结合成RNA/RNA双链体

双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译反义RNA的应用（一）治疗方法

根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义RNA

相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的mRNA的起始翻译位

点结合成RNA/RNA双链体

双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿mRNA上移，抑制翻译反义RNA的应用（一）

反义RNA的应用（二）

反义RNA的应用（二）

反义RNA的应用（二）抗HIV-l的作用：从翻译水平封闭基因表达，并干扰mRNA的剪切、加工而实现抗病毒作用tat为HIV-l重要的调节基因，编码反式激活因子Tat蛋白在逆转录病毒启动子LTR之后连接反义tat与多聚TAR的构建物(LTR-25TAR-AS-TAT)，具有反义tat及TAR诱饵的双重作用由于LTR启动子受Tat蛋白反式激活，使tat在HIV-l感染的细胞中得以高表达将这种外源基因导入Molt-3T细胞系、CEM-SST细胞系及健康人外周血单个核细胞(PBMCs)，对实验及临床分离病毒株均有抑制作用

反义RNA的应用（二）gag是HIV-1的结构基因，编码p24等病毒结构蛋