第三章+3-2+目的基因的获得

第三章目的基因的获得

－目的基因的分离克隆及其方法2第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因 （一）mRNAdifferentialdisplayPCR (DDRTPCR)3

差式显示的基本策略是通过反转录与PCR扩增mRNA中特定的一小部分，用DNA序列分析胶（6％－8％）同步分离显示扩增产物以进行比较。 首先要以5’－T（n）MN—3‘(3’固定引物．3’anchoredPrimer，其中n＝10一20，M＝dA／dC／dG，N＝dA／dC/dT／dG）作引物，将待比较的mRNA进行逆转录得到单链cDNA，由于该引物具有poly(dT），故可与mRNA的3’-poly(A)结合，而另外两个碱基MN的作用是使它定位在poly(A)5‘端．并使它只介导约1／12的mRNA的逆转录。 逆转录之后，以单链cDNA为模板，立即进行PCR，3’端引物就是上述3‘固定引物，5’端引物是10－13个碱基的随机引物。4

在细胞A中表达而不在细胞B中表达的基因．若引物合适，就可能在A的PCR产物中发现相应的基因片段，而不会在B的PCR产物中发现该片段。

5’端引物较短，特异性较低．能以相对较高的机率与cDNA5‘端结合，从而保证每一对引物都能扩增出适当数量的DNA片段(约50－150条)。若片段数过少，要对全部mRNA进行比较就必须合成大量引物，进行大量PCR；若片段数过多，又会增加分离纯化的难度。 当每次PCR扩增50—150个片段时，通过对12个3’引物和25个5’引物的不同组合，可以在95％的情况下分析15000个不同的基因，基本包括单个细胞所能表达的全部基因数。5P.Liang等人设计合成了全部12种不同的引物，用以反转录mRNA，合成第一链cDNA。这种引物通常叫作3'-端锚定脱氧核苷酸引物，并用5'-T11MN或5'-T12MN通式表示。其中M为除了T以外的任何一种核苷酸（即A、G或C），而N则为任何一种核苷酸（即A、G、C或T），故MN共有12种不同的排列组合方式。

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11例：印度芥菜镉胁迫响应基因的克隆与初步分析

应用FDD技术鉴定和分离印度芥菜Cd胁迫响应基因荧光标记mRNA差异显示每一条泳道均有约30条大小不等的扩增产物，各组间可见较多呈有无或强弱变化的差异条带，差异显示分析共获差异表达的cDNA片段67条，其中上调43条（包括增强带和新带），下调24条。Northern

blot和反Northerndot-blot分析印度芥菜Cd胁迫响应上调表达基因17上调基因序列与GenBank数据库中与病菌感染、脱水、冷、高盐、ABA、热和紫外线等生物或非生物胁迫相关的基因序列表现了很高的序列同源性，暗示Cd胁迫信号与其它生物或非生物胁迫信号之间存在着交叉对话或同一的信号途径。抗氧化系统在植物抗重金属胁迫中发挥重要作用。高的抗氧化能力可能是印度芥菜富集Cd的一重要机制。18第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因（一）mRNAdifferentialdisplayPCR (DDRTPCR) （mRNA差式显示）

(二）cDNArepresentationaldifferenceanalysis（cDNARDA）(cDNA代表群差别分析）19 RDA是近年发展起来的一种对基因水平上的差异进行分离基因的方法。它最初是由LisitsynN．等人建立的，用来对不同的基因组进行分析。后来，Hubank和Schatz对此法进行了改造，使它适用于cDNA水平的分析。

RDA和DD－PCR法是分子生物学中进行基因差别分析的两个重要的方法。与差示杂交和cDNA文库突变体补偿等传统方法相比，它们具有简便迅速的优点。

RDA的基本原理是将减法杂交与PCR扩增相结合，通过引物序列的选择使得只有特异存在于检验组中的序列能够被指数扩增．从而达到对其进行富集的目的。20

基因组RDA与cDNARDA实验步骤基本相同．主要区别在于每步酶切。使用基因组DNA时由于复杂度大，应使用识别位点相对比较不常见的内切酶(一般用6碱基限制酶)，又因PCR倾向于扩增较短的DNA（有效扩增长度一般150—1000bp），这样得到的代表群(representation)实际只代表该基因组的一部分。于是就降低了复杂度，便于目的基因的富集。 使用cDNA时，复杂度比基因组小得多，不需再降低，故使用识别四核苷酸位点的酶。这种酶切片段平均长度只有256bp，故使得绝大部分基因能有至少一个片段被有效地扩增，从而包括代表群。 此外，由于基因组水平的差异是绝对的．即有或无，而cDNA水平的差异通常只是表达量上的差异，故在减法杂交步骤上，cDNARDA有时需适当降低driver:tester的比率以便能得到仅仅表达量有一定差别的基因片段。21222324第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因(三）cDNAsubtraction25cDNAsubtractionreversetranscribehybridize26cDNAsubtraction(continued)reversetranscribeandPCR-amplifycloneintosuitablevector27第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因(四）抑制性差减杂交(SSH)

Suppressionsubtractivehybridization:amethodforgeneratingdifferentiallyregulatedortissue-specificcDNAprobesandlibraries28原理：

SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构,无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离29方法提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶切割实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头进行2轮差减杂交和抑制性PCR获得富集的目的基因30第三章目的基因的获得二.根据mRNA的特异性分离目的基因(五）cDNAdifferentialhybridization ordifferentialscreening (cDNA文库差别筛选）31removeexcessprobeandautoradiographDifferentialfilterhybridizationreversetranscriberadiolabeledcDNAtransfertotwonylonfiltershybridizefilterswithradiolabeledcDNA32Filterhybridization(continued)localizedifferentiallyexpressedcDNAclonesonplatecomparefilmsandpinpointuniquehybridizationsignalsidentifybyDNAisolationandsequencing3334ProbeIProbeIIAAAAATTTTT5’platephageonlawnofE.coliputativecloneofdifferentiallyexpressedRNAtwofiltercopiesProbeI:cDNAfrominfectedtissuecDNAsynthesisProbeII:cDNAfromhealthytissue12libraryconstruction34Differentialhybridization35AAAAATTTTT5’cDNAsynthesis12libraryconst