第三章 酶的分离纯化

第三章：酶的分离纯化酶分离纯化的目标：使酶制剂具有最大的催化活性和最高纯度。要点：酶主要还是蛋白质，能用于蛋白质的分离纯化方法通常可用于酶。要尽量减少酶活损失。要分清是胞内酶还是胞外酶根据酶的用途采用不同的方法3.1酶分离纯化流程酶原液否胞内酶细胞破碎提取分离浓缩干燥预处理细胞分离3.2酶纯度的评价总活力的回收率比活力提高的倍数酶的纯度实用价值＜－－侧重科研3.2.1酶总活力回收率与提纯倍数1总活力的回收率：反映提纯过程酶活力的损失情况。总活力的回收率＝纯化后总活力/纯化前总活力*100%2提纯倍数：反映纯化方法的效率纯化倍数＝纯化后的比活/纯化前的比活示例：腺苷酸激酶纯化表（6kg猪肉）纯化步骤总体积总蛋白总活力比活力纯化倍数回收率

抽提16600435000.04130.951100ml mg katal katal/kg%调pH1570011200 3.25层析13801716 13.02凝胶过滤211462 43.17结晶- 344 46.53.2.2酶的纯度检验注意标明使用何种方法检验的.不同方法检验的纯度可能不一致。如电泳纯、层析纯、HPLC纯。常用的检验酶纯度的方法方法 特点超速离心检测杂质＜5%时不太满意，不适合络合解离体系电泳必须在多种pH值下进行，单一pH两种酶可能一 起移动SDS－电泳可测出分子量，多亚基时会出现多条区带等电聚焦检测杂的极灵敏方法，有时会出现表观异质现象N－末端分析只适用于一条肽链免疫技术高度的专一性，但抗血清制备较为麻烦3.3分离与纯化分离（提取）：在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中。纯化：通常先根据溶解度性质用沉淀的方法（如盐析、有机溶剂沉淀等），制得粗酶，再根据酶分子的大小、电荷性质、亲和专一性，将酶纯化。3.3.1细胞破碎的方法机械破碎法物理破碎法化学破碎法酶促破碎法P72-733.3.2酶提取的方法盐溶液提取法酸溶液提取法碱溶液提取法有机溶剂提取法p76根据酶的溶解性质，选择适当的溶剂。3.3.3影响酶提取的主要因素1提取目标:提高提取率减少酶活损失。1)温度：温度过高易导至酶失活，应控制在0－10℃，对于稳定性高的酶提高温度有利于提取。2）pH:pH应远离等电点以提高溶解度，但pH不宜过高或过低，防止酶失活。3)提取液用量：用量增加，提取率增加但分离成本提高。一般为原液的3-5倍4)添加保护剂：加入适量的酶作用底物、辅酶或抗氧化剂可以提高酶稳定性，减少酶活损失。1分离过程中新设备、新技术的应用会取得事半功倍的效果。如离心机、过滤机的选择。采用膜分离技术等。2.浓缩与干燥过程尽量使用低温过程减少酶失活，同时可添加一些保护剂以减少酶失活。提取时的注意事项3.4沉淀分离沉淀分离方法：盐析沉淀等电点沉淀有机溶剂沉淀复合沉淀选择性变性剂沉淀3.5离心分离借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小密度的物质分离的技术。常用于：细胞收集、细胞碎片和沉淀的分离及酶的纯化。选择离心分离注意选择适当的离心机、离心方法离心条件。3.5.1离心机的种类和用途常速离心机：转速在8000r/min内高速离心机：转速在1x104~2.5x104r/min内,高速离心会导致温度升高因为防止酶等失活，有的装有冷冻装置。超速离心机：转速在2.5x104~8x104r/min内，都装有冷冻装置，和其它一些控制系统。常速离心机高速离心机超速离心机超速离心机又可分为制备用超速离心机，分析用超速离心机，分析制备两用超速离心机。分析用超速离心机可用于样品纯度的检测、沉降系数和分子量的测定。分析用超速离心机一般都装有光学检测系统，自动记录仪和数据处理系统等。沉降系数单位离心力作用下，粒子的沉降速度。Svedberg,S=1x10-13sω角速度，t2-t1离心时间，X1,X2粒子距中心轴的距离3.5.2离心方法的选择p82常速和高速离心机只要选择合适的速度和时间就可以了而对于超速离心机离心方法可分为差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。1、差速离心采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。

主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。操作简单方便，但分离效果较差，并使沉降的颗粒受到挤压。2、密度梯度离心p82是样品在密度梯度介质中进行离心的方法。能使沉降系数比较接近的物质得以分离。ρ0ρ1ρnΡ0<ρ1。。。<ρn线性梯度离心还有凹形梯度和凸形梯度。不同大小和形状的颗粒在密度梯度溶夜中形成若干条界面清楚的区带密度梯度系统可在溶剂中加入一定的溶质制成密度梯度系统。要求介质有足够大的溶解度，不与组分反应，且不会引起分离组分的凝集、变性或失活。常用的介质有蔗糖和甘油。蔗糖的梯度范围为：浓度5%~60%，密度为1.02~1.30g/cm33、等密度梯度离心p83当分离组分的密度ρ<ρi时颗粒上浮而ρ>ρi时下沉，而ρ=ρi颗粒停留在该处形成区带。使得待分离的物质ρ处于离心介质等密度处ρi形成区带的离心方法。要求溶液的密度比较大要等于分离组分的密度，因此常用銫盐如CsCl、Cs2SO4、CsBr等当分离组分的密度已知则可直接用等密度离心而不用梯度。3.5.3离心条件的确定离心力离心时间温度和pH：防止酶凝集、变性和失活。温度通常在低温下进行，高速和超速离心必须采用冷冻系统，防止发热。pH应控制在酶稳定的范围内，同时要尽量不采用过酸或过碱溶液，避免对转子或离心机腐蚀。3.6电泳主要用于酶的纯度鉴定、酶分子量测定、酶等电点测定及小批量酶的分离纯化。常用的是凝胶电泳和等电聚焦电泳。电泳仪3.6.1凝胶电泳以各种具有网状结构的多孔凝胶作为支持体的电泳技术。同时具有电泳和分子筛的双重作用。

常用的支持体是聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)连续凝胶电泳不连续凝胶电泳：具浓缩作用浓度梯度凝胶电泳:用于测定球蛋白的分子量SDS-凝胶电泳1不连续凝胶电泳分成三层：样品胶、浓缩胶、分离胶。特别适用于稀溶液的分离。-+样品胶浓缩胶分离胶2、SDS-凝胶电泳制备凝胶时加入1~2%的十二烷基硫酸钠，制成SDS-凝胶。3.6.2等电聚焦电泳在电泳系统中加入两性电解质载体,通电后在电场中形成一个由阳极到阴极连续增高的pH梯度。待分离组分在电场作用下移动到与其等电点相当的pH位置上，使不同等电点的物质分离。特点分辨率高：可分开等电点相差0.01~0.02pH的蛋白质。克服了电泳的扩散作用：时间越长区带越窄。与点样位置关系不大：不论点在何处都可以聚焦到等电点位置。重现性好可分离很稀的样品可准确测定蛋白质或多肽的等电点。对等电点处不溶解或发生变性的蛋白质不适用载体两性电解质要求