第14章 基因工程与蛋白质工程

基因工程与蛋白质工程第一节生物工程概述一、生物工程的概念及研究技术二、生物工程在现代工业、农业、医学实践中的应用

一、生物工程的概念及研究技术1．基因工程―在分子水平的遗传操作技术

基因工程是生物工程的主体和核心。它是指对不同生物的遗传物质（基因），在体外人工“剪切”、“组合”和“拼接”，使遗传物质重新组合，然后通过载体（微生物质粒、噬菌体、病毒），转人微生物或高等生物细胞内，进行无性繁殖(称为克隆，clone)，并使所需要的基因（称为目的基因）在细胞内表达，产生出人类所需要的新产品，或创建新的生物类型。基因工程卞要涉及DNA的复制、转录和表达，是在分子水平上的一种操作技术，所以它是分子水平的生物工程。转基因动植物就是利用重组DNA技术，将动物植物或微生物中经过鉴定和分离的特定基因，经过精心设计后转移到动植物体内，实现定向改造而获得新品种或产生新的生物功能。一、生物工程的概念及研究技术2．细胞工程―遗传物质在细胞间的转移

细胞工程（cellengineering）是在细胞水平和亚细胞水平的生物工程。包括细胞融合、核移植、细胞大规模培养快速繁殖技术和细胞克隆技术。细胞融合是不同种类的细胞，通过生物学、化学或物理学方法，使其原生质体融合在一起，这可以克服远缘种间的不亲和性，扩大遗传重组范围，筛选杂种后代；细胞大规模培养技术，是以工业生产为目的，不受气候、季节等限制，从大量培养的细胞中获得药物和其他有用物质；组织培养快速繁殖技术，是利用动植物组织和细胞的全能性，进行快速的无性繁殖，在比天然生长发育短得多的时间内得到动植物幼苗或组织，便于工业化生产。此外，还有通过显微或超微技术，将一种细胞的细胞核或某种细胞器转移到另一种不同细胞中的核移植和细胞质移植技术，可以产生具有超级功能的新细胞。一、生物工程的概念及研究技术3．酶工程―酶的改造与设计

酶工程（enzymeengineering）包括酶的开发与生产、酶的固定化和酶的分子改造与新酶研制等技术。在工业生产上，就是在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成所需的产品。酶的固定化技术，就是将酶（或细胞）与高分子化合物相结合，成为固相，便于长期反复使用进行连续化生产。这样，既保证了酶的特异催化作用，又延长了酶的使用寿命；酶的分子改造和化学修饰技术，是通过对酶分子主链的“切割”、“剪接”和侧链基团的修饰，以改变酶的物化性质（如提高稳定性）及生物活性（如提高酶活力、解除抗原性等），或者给酶赋予新的功能，大大提高酶的实用性；此外，根据对酶结构的研究以及结构与功能关系的阐明，按照人们的要求设计新的酶，也是酶工程的重要内容及研究方向，在更高层次上扩大酶的应用范围。一、生物工程的概念及研究技术4．生化工程（发酵工程）―生物工程产品的最终取得手段

生化工程（biochemistryengineering）包括生物反应器的设计、传感器的研制和产品的分离、精制技术。生物反应器是生物技术开发中的一个关键设备，它为微生物、活细胞或酶提供良好的环境，以使细胞增殖和产品积累。反应器系统的设计应逐步实现自动化的程序控制，具有良好的能量和反应传递性能，并适宜于细胞的大量增殖，或在产品的分离、精制中必须具有高纯度、高回收率的特点。这种反应体系如果用于微生物发酵，即是发酵工程(fermetengineering),它不同于传统的发酵技术。发酵工程是将传统的发酵与DNA重组、细胞融合等新技术相结合并加以发展的现代发酵技术，所使用的生产菌种应是通过生物工程手段选育、改造，并具有新的生物机能的所谓“工程菌”，因此，所得到的产品无论产量和质量都是传统发酵技术不能比拟的。二、生物工程在现代工业、农业、医学实践中的应用1．化工及冶金工业2．轻工和食品工业3．医药和医药工业4．农业和畜牧业5．环保和能源工业

1．化工及冶金工业生物工程在化学工业方面的应用越来越广，随着生物工程技术的进步，在这方面的应用前景十分广阔。它不仅可提供大量廉价的原料和产品，而且不断出现省能耗、少污染的新工艺，甚至给整个现代化工业带来革新。2．轻工和食品工业用生物工程技术改造传统食品工业，不仅可大为提高产量，改善质量，增进效益，而且可开发新产品，改善人们的膳食结构。目前在这方面主要包括氨基酸的发酵生产、酶制剂的开发利用、新糖原的开发、酒类酿造新工艺以及新型食品添加剂的研制等。3．医药和医药工业生物工程在医学研究、疾病的诊断和治疗、药物研究和新药开发方面是最活跃的领域，进展也十分迅速。现在，完全可以做到直接从基囚人手，在活体内从RNA、蛋白质、组织细胞以及生理或形态表型的水平上进行综合分析，了解许多疾病的发生机制。例如，美国科学家通过转基因动物模型研究纤溶酶原基因发现，该基因产物具有蛋白质溶解作用，当这个基因被剔除后，转基因小鼠便发现广泛的组织器官损害以及外科手术后的伤口愈合能力降低，而且进一步推测这个基因可能还与肿瘤细胞的转移、动脉粥样硬化、纤维性肺病、细菌感染等疾病或性状紧密相关。4．农业和畜牧业农业与人类的生活更为密切，现在各个国家都把生物工程在农业上的开发应用列为重点，促使农业真正向现代化方向发展。采用生物工程技术，在细胞和分子水平上研究和改造作物，将导致场新的“绿色革命”。

5．环保和能源工业生物工程产业除本身都是少污染工业外，还可用于环境治理，化害为利，不仅减少刘人类的危害，而且可增进经济效益和社会效益。

生物工程在环境保护领域目前主要是在两个方面：一是利用生物反应器来连续处理工业废水或含毒废液；二是利用基因工程技术，构建“超级菌”，以处理大面积的污染，如海洋石油污染。在处理废水方面，可利用一些特殊微生物或藻类，一方面可使污水净化，另一方面还可以回收金属等有用物质。现在有一种生物技术，利用细菌一藻类联合系统处理污水，细菌使水中的有机物分解，产生二氧化碳、氨和水。藻类则利用太阳能和水中的二氧化碳合成供藻类生长的有机物，同时产生大量藻类蛋白，并放出氧。所以通过这一系统的循环过程，既净化了污水，保护了环境，又获得了大量藻类蛋白，可作为高级饲料用于家禽及渔业，还可作为高级有机肥料用于园艺果蔬栽培等。第二节基因工程一、目的基因的获得二、基因载体三、重组DNA的筛选及表达一、目的基因的获得1．限制酶―特异切割DNA的手术刀2．取得目的基因的方法―分离法及合成法1．限制酶―特异切割DNA的手术刀限制酶（restrictionenzyme）是限制性内切核酸酶的简称，是一类水解DNA的磷酸二醋酶。与以往发现的一些DNA水解酶相比，限制酶在碱基专一性及断裂DNA链的方式上都有一些特殊的性质。限制酶作用于双链DNA，能够识别DNA分子上特异核营酸序列，造成双链切口，产生独特的DNA片段。由于它具有可控制、可预测的位点特异切割DNA的性质，从而成为在分子水平上解剖、绘制基因图谱、序列分析、克隆以及重新构建遗传信息的极其重要的工具。现在发现的限制酶都来源于原核生物。

2．取得目的基因的方法―分离法及合成法(1)DNA片段的直接提取用于基因工程的DNA分子经过限制酶处理后，切成大小不等的片段，从这些片段中分离出所需要的带有目的基因的片段，可采用一般制备DNA的方法，如凝胶过滤、离子交换或纤维素色谱法以及密度梯度离心等。用这种方法提取的DNA片段，其大小变化较大，在提取过程中也有被破坏的危险。由于全部DNA片段都被提取，必须经过大量筛选工作方能得到目的基因，因此盲目性大。但由于此法简单，并不需要繁杂的操作技术，故也常采用。

(2)用噬菌体（phage）或质粒（plasmid）直接从宿主细胞中将目的基因携出有些噬菌体能在宿卞染色体的特定位置插入，在它离开染色体时，可将与之连锁的基因一起带出。有些噬菌体在比较广泛的位置插人，则可带出更多的基因。例如，大肠杆菌乳糖操纵子的制各，曾采用两种特定的噬菌休，它们所携带的乳糖操纵子方向相反（一个噬菌休接于调节基因一边，另一个接于结构基因一边），当将来自二噬菌体带有正反基因的两条单链（将其变性后得到）进行退火时，操纵子部分可以重新形成双链，而其他部分仍然是松散的单链，再用单链核酸酶将单链部分切除后，留下的即是乳糖操纵了部分。(3)使用相应的mRNA分离基因利用酶法或化学法人上合成的mRNA，或使用从细胞中提取的mRNA，通过反转录酶（reversetranscriptase）的作用，即可合成相应的染色体DNA基因（称为CDNA）片段；或者用人工合成的mRNA作探钊，去“寻找”与之相应的染色体基因。二、基因载体1．质粒―染色体以外的遗传单元2．噬菌体―感染细菌的病毒1．质粒―染色体以外的遗传单元质粒（plasmid）是细菌染色体以外的能够进行独立复制的遗传单元，为双链环状DNA。它们的复制有的受染色体复制的严格控制。称为严谨型控制质粒(stlingentcontrolplasmid)；有的自行复制时并不受染色体复制的严格控制，称为松弛型控制质粒（relaxedcontrolplasmid）。基因工程中常用后一类质粒作为载体。质粒在细菌内所表达的性状，有耐药性、决定性性状、产抗生素、产溶血素、产毒素、产细菌素、抗金属离子、分解芳香族化合物等，选作基因载体时，选那些表型性状清楚、容易鉴别的质粒。常用的载体选择具耐药性和产生细菌素的质粒或将其改造后的衍生质粒，如pSC101、ColEl、pMB9、pBR322等。图14-1pBR322质粒2．噬菌体―感染细菌的病毒以噬菌体（phage）或病毒（virus）作为载体，将所需基因或含有此基因的DNA片段转移给受体细胞的过程，称为转导（transduce）。病毒的转导作用常常用于基因工程。在基因工程中常用作载体的噬菌体有入噬菌体及其衍生物、柯斯质粒（cosmid）及M13单链噬菌体等，以及感染真核生物的病毒SV40等。

噬菌体是感染细菌的病毒。噬菌体对细菌的感染有两种不同方式：种称为裂解；另种称为溶原。三、重组DNA的筛选及表达1．转化―带有目的基因的载体进入受体细胞2．筛选―从大量受体细胞中选出带有重组体的细胞3．表达―外源DNA在受体细胞中的转录和翻译图14-2DNA重组体的构建步骤1．转化―带有目的基因的载体进入受体细胞获得目的基因后，首先应将它与基因载体DNA连接，形成重组体。其连接的方法有几种不同情况。用同一种限制酶处理供体细胞的染色体和基囚载体，其切口处如果是黏性末端，则带有目的基因的DNA片段可以同载体的切口“粘接”起来，再通过DNA连接酶连接，形成重组体；如果切口处形成的是平端，DNA连接酶也可连接，但效率很低（只有黏性末端的1%）；或者用末端核苷酸转移酶催化，分别在载体切口和外源DNA片段一条链的3‘一OH末端添加寡聚T（或寡聚C），在另一链的3’一OH末端添加寡聚A（或寡聚G），这样用人为的方法形成黏性末端，便于形成重组体。

2．筛选―从大量受体细胞中选出带有重组体的细胞(1)插入失活法在现在的基因下程操作中，所使用的载体通常都是经过加工改造的衍生载体，它们要么带有一个或几个可供选择的遗传标记，要么具有被选择的遗传功能。例如，质粒载体具有抗药性或营养标记，噬菌体载体形成噬菌斑的能力或特征有所变化。这就使带有目的基因与不带口的基因的细菌有明显区别，便于筛选。

(2)放射性探针检测法利用mRNA可与相应的DNA段落杂交，来检测有外源DNA插入的重组体。是一种快速而灵敏的方法。有两种杂交法：一是利用放射性RNA作探针；二是形成R一环。放射性探针检测法是将转化菌铺放在琼脂平板表面的硝酸纤维素膜上，再进行培养。然后取出长有菌落的硝酸纤维素膜，用碱溶液处理，使菌落破裂，并使DNA变性。因为变性DNA同硝酸纤维素膜有很强的亲和力，便留在膜上，在80℃下烘烤膜，DNA就牢固地固定在膜上。再用放射性同位素标记的RNA（或DNA）同膜上的菌落杂交。经过一段时间后，用含有一定离子强度的溶液将非专一性结合的、仅仅是吸附在膜上的放射性物质洗去，烘干膜，进行放射自显影。凡是含有与放射性探针互补序列的菌落，就会在X光胶片上出现曝光点，即代表杂交上的菌落（图14-3）。再按底片上菌落的位置找出培养基上相应的菌落。如果需要，将它扩大培养后，再作进一步分析。

图14-3放射性探针检测法筛选DNA重组体(3)R一环检测法RNA通过取代与它序列一致的DNA链，同相应的另一条DNA杂交，被取代的DNA链与杂交双链RNA一DNA可形成一个突环（泡状），称为R一环。形成R一环的条件是高浓度（70%）的甲酞胺溶液和接近DNA变性的温度。在这种条件下，将RNA及DNA的混合物退火，RNA便同双链DNA分子中与它互补的序列退火而形成DNA一RNA杂交分子，因为DNA一RNA杂交分子比DNA一DNA分子更稳定，所以被取代的另一DNA链就被排斥而呈单链状态。此方法用于筛选重组体时，在有利于形成R一环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA，在含有mRNA的缓冲液中局部变性。如果质粒DNA存在着与mRNA探针互补的序列，mRNA就会取代DNA中一条链，而与另一链形成双链杂交分子，从而形成R一环结构。然后在电子显微镜下观察，可直接观察到R一环。这样便可检出重组体质粒DNA。(4)免疫测定法只要一个克隆的目的基因，能够在宿主细胞中表达，合成出外源蛋白质，就可用免疫测定进行检测。免疫测定法分为放射性抗休测定法和免疫沉淀测定法。放射性抗体测定法是将在固体培养基上由菌落所产生的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，再用相应的带有放射性标记（如125Ⅰ）的抗体进行反应，洗去非特异性吸附的放射性物质后，用放射自显影显示结果。免疫沉淀测定法是用一种特异抗体与外源基因表达产物蛋白质，在固体培养基上发生抗休抗原沉淀反应，根据沉淀物所产生的白色沉淀圈来加以检测。3．表达―外源DNA在受体细胞中的转录和翻译带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肤。因为基因表达是在一定调节控制下进行的，外源基因在受体细胞中要能表达，必须满足一定的条件。特别是真核基因在细菌中的表达。比如，真核基因表达的启动子能不能被原核细胞RNA聚合酶识别而进行转录；真核基因转录出的mRNA是否具有核糖体结合位点，使翻译能顺利进行；翻译产生的蛋白质能否通过细胞膜而排出细胞；外源蛋白是否会被受体细胞中的蛋白酶降解而失活。总之，基因工程要达到最后目的取得功能蛋白，必须依赖于目的基因的有效转录和mRNA正确的翻译及翻译后加工，如果这些环节中任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因上程的失败。第三节蛋白质工程一、蛋白质工程的概念二、蛋白质工程的一般技术三、蛋白质工程的应用一、蛋白质工程的概念1．基因定点突变―定做新蛋白质2．蛋白质设计―对天然蛋白质的修饰

1．基因定点突变―定做新蛋白质这是根据蛋白质结构研究，设计一个新蛋白质的氨基酸序列，通过修饰编码原蛋白质的DNA序列，最后创造出新的蛋白质的技术。人们长期以来一直希望制造出比天然蛋白质性能更好的新的蛋白质。曾经采用多肤合成的方法从头合成蛋白质，但其局限性很大。虽然有几个成功的例了，但要合成更大的蛋白质是很难实现的，而人工合成的蛋白质并不一定能够折叠成天然蛋白质的构象。因此，受基因工程的启发，解决合成新蛋白质的捷径还得从DNA分子水平入手。根据新设计的蛋白质的氨基酸序列，使DNA在体外发生突变与重组，形成新的基因，然后利用基因工程技术，得到所需的蛋白质。这种对天然存在的结构进行有针对性的突变而产生有活性产物的过程，叫寡核背酸诱导的定点突变，简称定点突变（sitedirectedmutagenesis）。可见