近交系大鼠全层皮肤缺损修复的实验研究

近交系大鼠全层皮肤缺损修复的实验研究

组织工程皮肤是解决大面积深度烧伤患者皮肤来源不足的主要途径，但现有组织工程皮肤产品的应用效果并不理想。主要有两个原因。首先，生成的组织工程皮肤的种子细胞通常是异体异体的异体异体，通常由于免疫排斥反应而脱落，并不能永久修复伤口。其次，使用树皮支架的三维穿孔结构远离通常的真皮基质，机械工程差，使用过程中操作困难。因此,利用患者自体细胞与保留有正常皮肤力学结构的同种异体脱细胞真皮基质复合构建组织工程皮肤,将是改善其应用效果的有效途径。既往研究中我们已建立了以人表皮细胞为种子细胞、脱细胞真皮基质为支架构建组织工程皮肤的方法。本研究将在该方法基础上,采用近交系F344大鼠的表皮细胞和SD大鼠的脱细胞真皮基质构建组织工程皮肤,再移植修复近交系F344大鼠全层皮肤缺损创面,利用同基因动物移植模型,模拟临床自体细胞源组织工程皮肤移植,通过大体观察、皮片成活率、创面收缩率及组织学观察,评价该组织工程皮肤修复全层皮肤缺损的效果,为其临床应用提供实验依据。1材料和方法1.1动物、培养基和实验仪器近交系F344雄性大鼠乳鼠(出生5d内)3只,体重(15±5)g;健康4~5周龄近交系F344雄性大鼠41只,体重(200±20)g;购自上海实验动物中心。6月龄雄性SD大鼠5只,体重(400±20)g,购自山西医科大学实验动物中心。限定性角质形成细胞无血清培养基(definedkeratinocyte-serumfreemedium,DK-SFM)、DispaseⅡ型和Ⅳ型胶原(Invitrogen公司,美国);L-DMEM培养基、胰蛋白酶(Sigma公司,美国);FBS(HyClone公司,美国);胶原蛋白海绵(北京益而康生物工程开发中心);Transwell培养皿(Corning公司,美国)。CO2培养箱(Thermo公司,美国);倒置相差显微镜(Olympus公司,日本);TDZ4-WS型低速台式离心机(湖南湘仪离心机仪器有限公司)。1.2脱细胞含皮质的制备取近交系F344大鼠乳鼠3只,脱臼处死后无菌获取腹/背部2cm×2cm皮肤,利用Dispase-胰蛋白酶两步消化法分离培养表皮细胞。取SD大鼠,脱臼处死后无菌获取腹/背部皮肤,皮鼓反取制备厚度为0.25~0.40mm的刃厚皮,按照高渗盐-SDS-胰蛋白酶化学处理法制备脱细胞真皮基质。将培养的第2代表皮细胞以浓度为1×109个/L接种于预处理的脱细胞真皮基质上,添加含10%FBS的DK-SFM培养基,使脱细胞真皮基质完全浸没,于培养箱中培养1周(浸没式培养)后将其转移至气液分离支架上,添加DK-SFM培养基,其液面与真皮支架底部平齐,从而使细胞部分暴露于空气中,继续培养1周,体外构建组织工程皮肤,取样品行HE染色观察。1.3创缘观察和创缘率检测取4~5周龄近交系F344大鼠5只,3%戊巴比妥钠腹腔注射(0.12~0.20mL/100g)麻醉,背部备皮、消毒,于两侧距离中线2cm处对称制备深达深筋膜的全层皮肤缺损,创面面积分别为1.0cm×1.0cm(A组)和1.5cm×1.5cm(B组);充分止血后覆盖1层无菌油纱布,外层覆盖无菌干纱布,包扎固定。制模后1周及2周观察两组创面愈合情况,采用透明塑料膜沿创缘标记,扫描入计算机后用ImageProPlus5.1图像分析软件计算创面面积,并按以下公式计算创面收缩率:创面收缩率=(创面初始面积-测量时创面面积)/创面初始面积×100%。根据以下标准选择适合的创面面积:制模后1周创面收缩率<20%,2周内创面收缩率<50%,则该缺损面积对干预因素具有评价作用。1.4大鼠皮肤非原位移植局部移植取4~5周龄近交系F344大鼠36只,按1.3方法及确定的创面面积于大鼠背部对称制备1.5cm×1.5cm全层皮肤缺损,72个创面根据修复材料不同,随机分为3组,各组24个创面,每只大鼠两侧均移植不同修复材料。实验组采用组织工程皮肤、阴性对照组采用同种异体脱细胞真皮基质、阳性对照组采用自体全层皮肤(非原位移植)修复创面,移植后于修复材料上方覆盖胶原蛋白海绵(厚度0.1mm,提前浸泡于生理盐水)作为表层敷料,外层敷料为无菌油纱布和干纱布,以自制移植保护装置固定。术后大鼠单笼饲养;2周后拆除固定装置。1.5观测指标1.5.1一般观察1.5.2皮片的红色解析术后4周观察移植皮片成活情况。自定义皮片成活标准:皮片颜色红润,有光泽,触之无漂浮感,与受区贴附紧密,无水疱和血肿等。按以下公式计算皮片成活皮率:皮片成活率=成活皮片数/植皮数×100%。1.5.3伤口的收缩率术后1、2、4周,按1.3方法计算各组创面收缩率。1.5.4皮肤组织病理学观察术后1、2、4周,大体观察及创面收缩率测算完毕后,用手术剪切取移植皮片及周围5mm正常皮肤组织,4%甲醛固定,浸蜡、包埋、常规切片,片厚4μm,行HE染色,光镜观察移植皮片及创缘炎性反应、表皮再生及真皮胶原改建情况。1.6均数方差分析采用SPSS10.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD法;计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验;检验水准α=0.05。2结果2.1皮肤组织结构HE染色示,构建的同基因细胞源组织工程皮肤由多层表皮细胞和交互排列的胶原束组成,表皮细胞与胶原纤维紧密连接,局部可见表皮细胞沿纤维间隙向胶原基质内长入(图1)。2.2两组患儿术后2周的创创率术后1周,两组创面均呈暗红色,同时创缘开始向心性收缩,A、B组创面收缩率分别为35.62%±6.75%和16.14%±5.18%;术后2周,两组创面面积均明显缩小,表面有暗红色结痂,A组收缩后呈点状,B组收缩后呈类椭圆形,A、B组创面收缩率分别为75.23%±9.57%和37.46%±7.42%。根据皮肤缺损模型判定标准,选取B组1.5cm×1.5cm缺损面积作为后续实验动物模型全层皮肤缺损面积。2.3动物移植实验2.3.1材料的缺失术后1周,实验组和阴性对照组表层敷料均完整覆盖整个创面,移植皮片与创面紧密结合,表面无渗出;阳性对照组自体皮片有脱屑现象(图2a~c)。2周,实验组创面周围交界处表层敷料出现部分脱落,露出的创面呈粉红色,与周围自体组织边界模糊,除创面中央有小出血点外,其余部分表面均可见一层透明薄膜,触之柔软有弹性;阴性对照组表层敷料仍未见脱落;阳性对照组皮片柔软,活动度好,呈红色(图2d~f)。3周,各组表层敷料均自动脱落。4周,各组缝线大部分脱落,实验组组织工程皮肤透明度下降,与周围组织紧密连接,外观已接近周围正常皮肤,但无毛发生长,触之柔软有弹性,达到Ⅰ期愈合;阴性对照组创面收缩明显,且创面中央仍有红褐色结痂;阳性对照组自体皮片与周围组织间有白色瘢痕线作为界限,颜色、毛发和皮片活动度等均与创缘组织无明显区别(图2g~i)。2.3.2两组皮片成活率比较术后4周,阴性对照组创面均未愈合;皮片成活率为0。实验组皮片成活率为62.5%(15/24),阳性对照组为91.7%(22/24),两组比较差异有统计学意义(χ2=5.779,P=0.016)。2.3.3两组间创复率比较随观察时间延长,各组创面收缩率有增大趋势,尤其是术后4周收缩明显,各组组内不同时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后1、2周,各组间创面收缩率比较差异无统计学意义(P>0.05);4周时实验组和阳性对照组创面收缩率显著低于阴性对照组(P<0.05),实验组与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。2.3.4皮肤组织病理学检测术后1周,实验组移植皮片均有薄层表皮细胞覆盖,细胞无明显分层,近创缘处表皮细胞增生变厚,皮片下真皮层胶原束粗大卷曲,胶原纤维结构完整,有少量炎性细胞散在分布。阴性对照组仅在创缘处可见增生的表皮细胞,中等量炎性细胞浸润,主要集中于真皮乳头层,低倍镜下呈嗜碱性着色,高倍镜下显示炎性细胞主要为中性粒细胞。阳性对照组移植皮片中央表皮有部分变性脱落,真皮胶原无明显变化,毛囊和腺体中部分细胞核呈固缩现象,创面底部有中等量炎性细胞浸润(图3a~c)。术后2周,实验组创面表皮层明显增厚,真皮层可见从创面底部沿垂直创面方向向胶原内部增生、以及从创缘处平行于创面向表皮层与真皮基质间大量增生的小血管和成纤维细胞。阴性对照组真皮表面也有多层表皮细胞覆盖,但尚未完全覆盖创面,且表皮与真皮连接不紧密,常见表皮与真皮基质分离,真皮内部也有成纤维细胞和小血管增生。阳性对照组移植皮片表皮层完整,创缘处表皮细胞仍处于增生状态,真皮层毛囊和腺体中细胞饱满,且在表皮层与真皮基质间也可见增生小血管和成纤维细胞(图3d~f)。术后4周,实验组表皮层数较2周时减少,但层次更分明,与创缘表皮细胞无明显差别,可见由增生的表皮细胞深入至真皮基质内部而形成的表皮脚,真皮内部成纤维细胞和小血管开始减少,且可见薄层纤细的胶原纤维;网状层局部可见粗大的胶原纤维束被新生胶原成分代替。阴性对照组创面有多层表皮细胞增生,但中央部分未被覆盖,表皮与真皮连接处平坦,未见表皮脚,真皮内部也可见新生丝状胶原纤维形成,同时移植皮片上层有厚而致密的胶原纤维,类似于瘢痕组织。阳性对照组自体移植皮片与周边组织之间被瘢痕组织填充,在自体皮片真皮乳头层也可见纤细薄层胶原结构,血管和成纤维细胞数量减少(图3g~i)。3皮肤移植模型的建立目前自体皮肤移植仍是治疗重度皮肤损伤的最佳治疗方法,但对糖尿病造成的慢性溃疡,自体皮肤移植的修复效果并不理想;此外,当烧伤患者受损创面超过全身总面积50%时,可供移植的自体皮无法满足手术需要,且供区将遗留瘢痕,严重影响外观及功能。因此,体外构建一种低免疫排斥、可永久性修复创面的自体皮肤替代物具有重要意义。近年来组织工程皮肤作为一种新生的自体皮肤替代物备受关注。组织工程皮肤是利用组织工程方法将皮肤种子细胞与真皮支架结合,体外构建一种具有修复、维持和改善受损皮肤组织功能的自体皮肤替代物。因此,种子细胞和真皮支架是构建组织工程皮肤的必要元素,也是决定是否有排斥反应和移植是否成功的关键。本研究中所用真皮支架为同种异体脱细胞真皮基质,其主要成分为Ⅰ型胶原蛋白,即使是异种胶原蛋白其免疫原性亦很低,移植后很少发生免疫排斥反应;细胞是免疫原的主要载体,如人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,HLA)即表达于细胞表面,由于HLA的高度多态性使得移植时宿主把异种细胞视为“异己”而发生排斥反应,因此组织工程皮肤理想的种子细胞为自体细胞。Clover等开展的问卷调查结果也显示绝大多数患者(94%急性烧伤患者、95%糖尿病患者及93.9%帕金森患者)在选择组织工程皮肤细胞来源时仍首选自体细胞。传统的自体细胞源动物移植实验模型通常需获取每只受试动物(如大鼠)的小块皮肤,逐一转移至无菌室进行培养,并遗留创面需要护理。这不仅增加了工作量,也会出现因无菌操作失误或供皮区创面感染导致实验动物损失,因此传统自体细胞源动物实验具有一定局限性。本研究引入近交系F344大鼠同基因皮肤移植模型以模拟自体细胞源皮肤移植。近交系大鼠具有特殊的遗传生物学特点,即同一群体间具有相同的基因型和表现型,对外界的反应刺激也一致,因此近交系内部的移植属于同基因移植,近似于自体移植,相对于传统的自体细胞源动物模型,该实验方法更加简化,结果更具可靠性和可重复性,避免了实验动物的不必要损失。建立近交系大鼠全层皮肤缺损动物模型首先需要确定创面面积。一般皮肤受损后均经历炎性反应、细胞增生、肉芽组织形成等阶段,因肉芽组织中含有大量肌成纤维细胞而使创面自然收缩,即使不施加干预因素,创面也会由于收缩和外周表皮细胞移行覆盖而趋于自然愈合。为克服自然愈合对干预因素的影响,本研究结合参考文献和近交系F344大鼠背部的实际面积,设计1.5cm×1.5cm和1.0cm×1.0cm两种缺损创面,观察周期为2周,根据预实验结果及文献,设定了模型建立标准。结果显示1.5cm×1.5cm符合模型建立标准,后续实验采用该缺损面积建模。理想的皮肤修复材料不仅要实现表皮完全再生,同时还要恢复真皮结构,避免瘢痕形成,减少挛缩。本研究皮肤修复材料为同基因细胞源组织工程皮肤,其真皮支架为同种异体脱细胞真皮基质,不仅具有良好的生物相容性,促进表皮细胞分化生长,而且保留有正常真皮天然的三维网状结构和力学强度,移植后可抑制肉芽组织生长、瘢痕形成和创面收缩。但同种异体脱细胞真皮基质发挥该作用需要一定条件,即必须有表皮存在,或与表皮细胞体外构建含表皮层的组织工程皮肤,或与自体刃厚皮组合,其单独应用无法封闭创面和抑制瘢痕形成。本研究结果显示,阴性对照组术后创面出现明显收缩,4周时创面收缩率达53.63%±9.06%,约为实验组的1.6倍和阳性对照组的1.8倍,而实验组组织工程皮肤抑制创面收缩效果与自体皮肤相近。组织工程皮肤是“有活力”的移植物,所谓“活力”主要指组织工