卡拉胶降解酶的分离纯化

#1.前言卡拉胶是一种具有商业价值的亲水凝胶（属天然麒麟糖植物胶），主要存在于红藻纲中的麒麟菜属、角叉菜属、杉藻属和沙菜属等的细胞壁中。卡拉胶是由，1,3-P-D-吡喃半乳糖和1,4-a-D-吡喃半乳糖作为基本骨架，交替连接而成的硫酸线性多糖。与琼胶相比，卡拉胶所有的卜连接和a（1-4）连接的残基都是D构型，但琼胶在a（1-4）连接半乳糖基上在中是L-构型。对卡拉胶来说，它的结构在a（1-4）连接的半乳糖基上还形成了3,6-内醚，见图⑴^-cEjrrflgaenfln^-cEjrrflgaenflnT-卡拉胶，九-T-卡拉胶，九-卡拉胶，Y卡拉胶，U-［胶，於卡拉胶。另一种分类方法是根据己确定的各种卡拉胶,卡拉胶可分为八种类型。卡拉胶类型的理想的卡拉胶重复二糖的结构特征，以及1，3-连接的D-半乳糖上的硫jgfcjt酸基位置，可将各类型的卡拉胶分类为卜族卡拉胶、K-族卡拉胶、九-族卡拉胶。卡拉胶是从红藻如角叉菜、、杉藻、麒麟菜等中提取的一种水溶性多糖。我国早期曾称其为咖啦胶、角叉莱胶、鹿角菜胶，后统一为卡拉胶。有许多种红藻类都可以提取卡拉胶，目前世界上生产的卡拉胶有近一半是用麒麟菜作原料，此外还有角叉菜、海萝、杉藻、沙菜、银杏藻、叉红藻、育叶藻等均可提取卡拉胶，我国南方广东省用麒麟菜、北方辽宁省用角叉菜作原料生产卡拉胶［2］。而卡拉胶酶主要有K-卡拉胶酶，T-卡拉胶酶，九-卡拉胶酶等，其主要是依据所降解的底物命名的。许多海洋微生物如Pseudoalteromonascarrageenovora,Pseudomonascarrageenovora[3,4]等都能产出卡拉胶酶，其他来源例如在海洋软体动物(Marinemollusks)体内也有⑸。根据作用机制的不同卡拉胶降解酶可分为保持型和转换型两种。1995年，PhilippePotin等人报道了交替单胞菌A.carrageenovora的cgkA基因所编码的K-卡拉胶降解酶，预测其相对分子质量为44,212Da,远远大于经SDS测定的从发酵液纯化出的酶蛋白的相对分子质量35kDa°cgkA基因所编码的K-卡拉胶降解酶序列与GH16家族中其他成员的序列具有较高的相似度，GH16家族水解酶的催化区域多序列分布表明K-卡拉胶降解酶的G1U163残基在催化过程中起主要作用。免疫印迹实验表明天然和重组的细菌胞内提取物都存在一个分子量为44±2kDa的蛋白质分子，结果表明K-卡拉胶降解酶是以前体蛋白形式产生并在分泌过程中经历了两次蛋白水解切割作用，即先切去信号肽，然后再切去C末端的区域从302位点到397位点的96个氨基酸。成熟的k-卡拉胶降解酶由275个氨基酸组成。为了评定其作用的分子机制，通过使用凝胶过滤色谱和13C-NMR技术分析K-卡拉胶降解酶水解新卡拉六醇的产物，结果显示，最先形成的是新卡拉二醇和卩-新卡拉四糖，说明该酶作用的分子机制为保持异构体构型。2001年，GurvanMichel等人⑹在研究P.carrageenovora所产K-卡拉胶降解酶的活性部位时，首次提出隧道模型，并认为酶的隧道状活性部位与多糖的降解有关。其中谷氨酸残基E163，E168分别起到亲核催化作用和酸碱催化作用，天冬氨酸残基D165在催化循环中起促进最终转变状态解体作用。2003年，GurvanMichel等人⑺在研究I-卡拉胶的降解机制中通过使用Alteromonasfortis产的I-卡拉胶降解酶与I-卡拉胶相互作用，结果发现碱性蛋白残基和多糖链的硫酸基之间的相互静电作用在识别I-卡拉胶的过程中起主导作用。C末端的A结构域在天然酶中具有高度的灵活性，采用a/p的折叠形式。在底物与酶的复合体中，多聚阴离子模块向P螺旋的凹槽移动，形成一个隧道。在降解过程中酶从开放的形式转变成闭合的形式。I-卡拉胶降解酶的催化腔仅能容纳一条I-卡拉胶链，因此酶蛋白必须先把I-卡拉胶双螺旋从I-卡拉胶纤维结构中分离出来，然后再水解其中单一的I-卡拉胶链。多聚阴离子的I-卡拉胶链与卡拉胶降解酶的多聚阳离子的非催化表面相互作用，很可能取代了双螺旋之间的钙离子。非催化的外表面被看做一个楔子，可使双螺旋链与卡拉胶纤维分开，但其机理还未有明确的解释。I-卡拉胶降解酶的隧道型活性部位在打开I-卡拉胶双螺旋和阻止已分离的I-卡拉胶链重新结合到晶体上的过程中起到重要的作用。2007年，Guibet等人⑻对P.carrageenovor所产的九-卡拉胶降解酶进行了纯化、克隆和测序，序列分析结果表明，这一分子量为105kDa的酶蛋白分子具有特征性的区域，为一连接物连接至少两个相对独立的单元，N末端区域可能折叠成为卜螺旋桨结构。通过1H-NMR和LC-MALLS技术检测九-卡拉胶的酶解过程表明九-卡拉胶酶为内切酶，并通过异构体构型完全转换的分子机制来酶解九-卡拉胶。PotinP等1991年报道从红叶藻属(Delesseriasanguinea)分离了一株能够降解不同硫酸化半乳糖聚合物(琼胶或卡拉胶)的细菌，用硫酸铵，凝胶过滤色谱(SephacrylS200HR)，离子色谱(DEAE-Sepharose-CL6B)纯化K-卡拉胶酶，用SDS/PAGE电泳检测为单一蛋白质，测定酶分子量为40.000,最适pH7.2，300°C稳定，但在40C只维持山。SarwarG等1987年报道用2216E培养基添加商业0.1%卡拉胶培养噬纤维菌属的细菌Cytophagasp.lk-C783,分离胞外卡拉胶酶。用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤色谱(G-200)纯化得到k-卡拉胞酶，纯化的酶分子量用SDS/PAGE电泳测定为100000,K-卡拉胶酶的最适pH为7.6,最适温度为25C。金属离子对场Cytophagasp.lk-C783生长的影响，NaCl和MgCl2可被细菌利用，2216E中培养基最小浓度为0.05mol/LNaCl，0.25MgCl2。KCl和CaCl2对产酶没有作用，当营养物质充足的时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可以合成和释放。卡拉胶的降解方法可归纳为三类酸水解法、超声波降解法和酶解法。研究卡拉胶的热水或冷水提取物的化学结构，多用酸水解、甲基化、甲醇分解等方法处理。目前，普遍采用的方法是酸水解法。从生物角度来讲，卡拉胶是某些红藻的细胞壁多糖，通常附着在海藻表面的海洋微生物，会利用自身分泌的卡拉胶酶来降解卡拉胶，有效的利用藻类中的物质来获得能量。目前，卡拉胶酶被用作海藻解壁酶，以获得DNA，单细胞，蛋白质和原生质体。并且在卡拉胶粘度很大，提取非常困难的时候，添加卡拉胶酶以后可以使卡拉胶很快降解，粘度下降，大大方便了的提取。在卡拉胶的药理活性实验中，未降解的卡拉胶由于粘度大、扩散困难、很难吸收，且其毒性大，未达到有效量就能致死实验动物。为了克服这个困难，就需要使用卡拉胶酶降解卡拉胶，使其既保持药理活性又易吸收，减小毒性。而且降解的卡拉

胶是一种有效的体内致炎剂，已有几种酸降解的卡拉胶制剂被应用于临床上。降解的卡拉胶像肝素一样与血纤维蛋白原形成可溶络合物且毒性小，因此对卡拉胶酶的研究成为了迫切的需要。由于九-卡拉胶低聚糖可诱导植物胚胎发育过程中小孢子的形成，效果较热休克方法高两倍，有望成为植物培养中从小饱子获得双单倍体的新型的促进剂，所以在九-卡拉胶低聚糖的制备中，卡拉胶酶必将扮演重要的角色。到目前为止，虽然以低分子量形式出现的卡拉寡糖以其独特的活性成为近年来的研究热点，并且酶法水解卡拉胶与光谱和化学方法相比，它是一种简单、灵敏测定卡拉胶结构的方法，但卡拉胶酶的相关研究及应用还有待于进一步的发展，所以卡拉胶酶的应用还不是很广泛［9］。2材料2.1菌种Cellulophagalytisctrain:N5-22.2试剂K-卡拉胶：购自郑州世纪安华食品商贸有限公司；海水(大连开发区丽娇湾)PAGE(PolyacrylamideGelElectro-phoresis)电泳试剂：分离胶缓冲液：1.5mol/LTris-HCl缓冲液pH8.8电极缓冲液：3.0gTris和14.4g甘氨酸溶于H2O中，定容于1L,终pH为8.3DNS试剂：将6.3g3,5-二硝基水杨酸(3，5-Dinitrosalicylicacid，DNS)和2mol/LNaOH加到500mL含185g酒石酸钾钠的热水中，搅拌溶解后再加入5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000mL，贮存在棕色瓶中放置一周后使用。pH7.0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液:0.2mol/LNa2HPO416.47mL与0.1mol/L柠檬酸3.53mL充分混合，终pH为7.0。3仪器DNP-9162电热恒温培养箱DNP-9162电热恒温培养箱SHZ-D(III)循环水真空泵BS223S电子天平司；PHS-2C精密级数字式酸度计巩义市予华仪器有限公司；塞多利斯科学仪器(北京)有限公上海虹益仪器仪表有限公司；

MLS-3750高压灭菌机HDL1360-W洁净工作台MLS-3750高压灭菌机HDL1360-W洁净工作台HZQ-C空气浴震荡器TDL-5000B低速冷冻离心机SHZ-82S水浴恒温振荡器LG16-W台式高速离心机UV-2000分光光度计DHG-9140电热恒温鼓风干燥箱透析袋（截留分子量8000到14000）DYY-4C型电泳仪BCD-205TACS冷藏冷冻箱北京东联哈尔仪器有限公司；哈尔滨市仪器制造有限公司；上海安亭科学仪器厂；常州国华电器有限公司；北京京立离心机有限公司；尤尼柯（上海）仪器有限公司上海精宏实验设备有限公司；USA；北京六一仪器厂；青岛海尔股份有限公司；4方法4.1培养基的制备4.1.1种子液培养基K-卡拉胶0.1%，蛋白胨0.5%，酵母提取物0.1%,FeSO4・7H2O0.002%,陈海水，pH自然4.1.2固体平板培养基K-卡拉胶1%,蛋白胨0.5%，NaCl2%，无机盐母液110ml，蒸馏水890ml,琼脂1%，pH7.2粗酶液的制备将菌株Cellulophagalytisctrain:N5-2接到斜面培养基上活化72h后，再接种到装有50mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，150rpm振荡培养20h后,再按4%的接种量接入装有100mL发酵培养基的250mL的三角瓶中，35°C,150r/min振荡培养20h，得到发酵液。在4°C条件下，由于此酶为胞外酶，所以通过5000r/min离心30min,得上清液为粗酶液。（除非特殊之处，所有纯化步骤均在4°C条件下进行，以免酶失活）（NH4）2SO4进行盐析沉淀及K-卡拉胶酶粗酶的制备向粗酶液中逐渐加入（NH4）2SO4至40%饱和度，4°C静置沉淀过夜后，5000r/min冷冻离心去除杂蛋白后，再向上清液中逐渐加入（NH4）2SO4至80%饱和度，4°C静置过夜后，5000r/min冷冻离心收集沉淀并用少量冷却的蒸馏水溶解，置透析袋（MWCO：8000-14000Da）中用蒸馏水4°C透析脱盐，再经冷冻干燥即得粉状的k卡拉胶酶粗品，-20C保存。酶的分离纯化装柱取8g干胶（型号：SephadexG-200）加入300mlTris-HC缓冲液（pH7.5）,在室温溶胀72h，使其充分溶胀。煮沸10min去除气泡，准备装柱。装柱时，当凝胶颗粒连续缓慢沉降到沉积面到离柱顶端约3-5cm处，停止装柱，在顶端加入2-3cm高的缓冲液。平衡过夜。（用恒流泵在恒定压力下走柱子）加样与洗脱吸取多余缓冲液，观察床表面平整后，打开出口，待洗脱液流至与凝胶面相切时关闭出口，加少量样品（0.2g干燥样品，加入8ml洗脱液），根据凝胶量样品加入约5ml（通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积），再打开出口，是样品渗入凝胶。当样品将近完全渗入凝胶时，用滴管加入约4cm的洗脱液，然后接上恒流泵，进行洗脱纯化样品收集采用部分收集器来收集分离纯化的样品。每管收集约2-3ml。收集约130管，进行蛋白浓度和酶活力的测定。将得到的产品一般采用透析除盐，超滤或减压，薄膜浓缩，再冷冻干燥得到干粉，在低温下保存备用。蛋白浓度及酶活力的测定蛋白含量的测定将约130管收集的样品，以缓冲液调零，分别测量A280nm,做出曲线图。酶活力的测定将约130管收集的样品，分别取适量与适量底物（0.5%卡拉胶）反应，再加入适量DNS煮沸10min显色反应，后迅速用冷水冷却，冷却后再离心取上清液测540nm处OD值，根据标准曲线求出反应液中的还原糖含量，以煮沸灭活的酶液同法处理作为对照。与蛋白含量曲线进行比较。样品蛋白浓度的测定取适当稀释的未知样品蛋白质溶液1mL，加入考马斯亮蓝试剂5mL，摇匀后，室温放置5min，测定其OD595nm值，然后根据标准曲线求出样品溶液的蛋白质浓度（mg/mL）。4.6降解产物的鉴定4.6.1薄层层析进行鉴定将样品在薄层板上进行点样，将点好样品的薄层板放入展开缸的展开剂中（浸入展开剂的深度为距原点5mm为宜），密闭，待展开至规定距离（一般为8〜15cm）,取出薄层板，晾干。将除去展开剂的层析板碘缸，显色30min,即出现斑点，进行分析，鉴定。4.7电泳（样品酶的鉴定）将所得的K-卡拉胶酶粗品溶于少量的H2O中，与样品缓冲液按4：1相混

合后，10000r/min离心5min，不连续变性电泳（DiscontinuousNative）[9]。1）分离胶为7.5%，浓缩胶为2.5%，2）每孔的上样量为20yL,4°C条件下，20mA恒流下电泳至溴酚蓝指示剂跑到前沿0.5cm处（大约4h），使目的蛋白充分分开（大约10h）。结果5.1蛋白浓度及酶活力曲线图注：其中紫色上线为酶活力曲线，蓝色下线为蛋白浓度曲线根据此曲线图，可以看出蓝色的蛋白浓度曲线出现了3个大峰，分别是第7管，第20管和第33管，而且从第3管到第36管都有蛋白存在。而通过紫色的

酶活力曲线可以看出两个高峰，分别是第8管和第20管，说明第7管虽然蛋白浓度较高，但是酶活力并没有很高，而真正分离出来的酶主要在第8管中，第20管中蛋白浓度和酶活力都出现峰值，所以第20管中分离出了产品酶。而从第3管到第36管都断断续续的表现出有部分酶活力和蛋白浓度，分析为杂蛋白的干扰。5.2电泳结果（凝胶过滤收集样品的鉴定）注：混合样1：第3,5,6,7,9管混合；混合样2：第11，13,14,15,16,17,18,19管混合；混合样3：第25,28,30,32,34,37管混合；Marker:4.1KD-66KD根据电泳结果，可以看出第8管中蛋白质的分子量小于20KD，并大于14.4KD，并且几乎没有杂蛋白。而第20管的跑出的第二条带基本与第8管的带相同，而在此带上、下各一条蛋白带；根据后面的薄层层析的结果可以看出，其中除了与8管相同的酶蛋白外还应有另外一种酶蛋白。混合样1和混合样3基本上没有成分跑出，而混合样2跑出四条带，有三种成分的分子量大于20KD。根据前期的酶谱实验，推测分子量大于20KD的样品中一定有酶蛋白存在。

5.3薄层层析D半乳糖8管20管混合样图3薄层层析鉴定降解产物注：混合样1：第3,5,6,7,9管混合；混合样2：第11，13,14,15,16,17,18,19管混合；混合样3：第25,28,30,32,34,37管混合本层析对酶活力最大的两管第8管和第20管进行降解产物分析，并与部分管中的混合样和D半乳糖的降解产物进行对比说明。通过本图可以看出第8管与第20管所降解的产物有所不同。第8管出现了4种降解产物，而第20管降解出3种降解产物。三种混合样的降解产物基本相同，进一步说明了混合样中也有酶蛋白存在，并且可能为同一种酶。讨论在(NH4)2SO4沉淀时，一般采取少加，慢搅拌的方法，以免(NH4)2SO4产生凝块难以溶解，或者破坏酶活。同时，温度对本实验影响较大，操作一般在-4£以下进行，包括离心，否则会影响实验结果或者是酶完全失活。在初步分离过程中要求柱子装的要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡。若新装成的柱凝胶不均因或者出现气泡，需将凝胶倒出重新装填。另外，所用的凝胶处理要提前进行加热溶胀，即在沸水浴中，将悬浮的凝胶浆逐渐升温至近沸进行溶胀l-2h内即可完成，此法还可以消毒，杀死凝胶中污染的细菌，同时也排除凝胶中的气泡。在溶胀和处理过程中，不能进行剧烈搅拌，严禁使用电磁搅拌器，防止产生凝胶碎片，影响层析流速。样品上柱时，加样量的多少直接影响分离的效果。一般，加样量尽量少一些，分离效果会比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积。在实验中，根据蛋白浓度的曲线、电泳和薄层层析的结果来看，菌株N5-2产生至少3种卡拉胶降解酶，并且每种酶的降解产物不一样。这次利用SephadexG-200凝胶过滤层析的方法只将一种酶达到了分离纯化的目的。结论利用凝胶柱层析只能将一种酶分离纯化出来，而另两种酶没有得到很好的

分离，菌株N5-2产生至少3种卡拉胶降解酶，并且每种酶的降解产物不一样。

参考文献纪明侯，海藻化学，北京科学出版社[M],2007,177-187华汉峰，一种用途广泛的海藻胶一^拉胶[J]，水产科学，1990,9(1-10)MiehelG,BarbeyrionT.ActaCrystallogrD[J],BiolCrystallogr,1999,55(Pt4):918-920OestgaardK,wangenB.ENZYMEMICROB[J],TECHNOL,1994,15(4)326-355⑸刘岩，江晓路，管华诗，卡拉胶酶的研究进展[J]，微生物通报，2001，28(2)89-93MichelGChantalatL,DueeE,etal.TheK-carrageenaseofPcarrageenovorafeaturesatunnel-shapedactivesite:anovelinsightintheevolutionofclan-Bglycosidehydrolases.Structure[J],2001,9:513-525MichelG,HelbertW,KahnR,etal,Thestructuralbasesoftheprocessivedegradationofiota-carrageenan,Maincellwallpolysaccharideofredalgae.J.Mol.Biol[J],2003,334:421-433GuibetM,ColinS,BarbeyronT,etal.Degradationoflambda-carrageenanbyPseudoalteromonascarrageenovoralambda-carrageenase:anewfamilyofglycosidehydrolasesunrelatedtokappa-andiota-carrageenases.Biochem[J],2007,404(1):105-114于文公，拜晶晶，海洋细菌CellulophagaspQY201的卡拉胶酶研究[C],中国海洋大学，2006Chin-AnHsu,Roch-ChuiYi,Cheng-ChunChou.Purificationandcharacterizationofasodium-stimulated-galactosidasefromBifidobacteriumlongumCCRC15708.WorldJournalofMicrobiologyandBiotechnology[J],2006,22(4):335-361致谢本次试验的顺利完成以及论文的完稿，首先要感谢我的毕业论文指导老师吴海歌老师以及姚子昂老师的无私帮助与指导，他们以敏锐的学术思想、严谨的治学作风在论文从立题、实验到成文的整个过程中时刻给予正确的引导，整篇论文都浸透着老师的心血。感谢研究生王飞飞学姐和本课题组其他学姐学长的细心指导与帮助。感谢我的导师刘庆平老师在大学四年中，无论是学习或是生活上给予我的帮助以及引导，使我得以顺利走过大学本科四年至完成本篇论文。特别感谢我的亲人和朋友们在生活上，学习上给我的支持和帮助。这次的毕业设计实验和这篇论文没有他们的帮助，是不可能完成的。附录：外文译文水溶液中K-卡拉胶的酶降解标准K-卡拉胶的酶降解和经假交替单胞，沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶重组体处理过的K-/p-卡拉胶低凝胶混合物。酶的最初速度被决定作为改变Tris或者Nal的浓度和持续的200mM共存溶质浓度的功能，因而调节Tris和Nal的浓度。在这两种情形下，通过加大碘化物我们观测到强烈的酶的抑制作用。K-卡拉胶和K-加-卡拉胶的光学螺旋排列的描述和通过INMR可见的碘化物捆绑在卡拉胶上揭示了抑制作用不是被在NaI中卡拉胶的混乱排序转变所引起的，而是由于碘化物的捆绑。这些结论通过用凝胶色谱法对降解产物的分析加以证实。在混乱状态下的卡拉胶的降解导致急速的分子量和所有可能的新的角叉藻二糖低聚体的降低。在这宗排列构造下，降解动力学，平均分子重量的减少和降解产物的一系列数量分配随着碘化物浓度的变化而变化。这些观察被解释被束缚在卡拉胶螺旋上碘化物的数量增多的结果，依次地，阻止酶的催化作用。基于这些结果，我们提出K-卡拉胶为一个单螺旋排列结构状态来否决先前的双螺旋模型的提倡者。绪论卡拉胶是从许多种类的红海藻中萃取出来的被线性硫酸盐处理的半乳糖，以交互的分享一个a（1—3）和卩（1—4）联接共同的D-半乳糖骨干。卡拉胶根据硫酸盐酯团的数量和位置和在1,4-连接单元上的一个3,6-酐桥的存在与否来分类。例如，K-卡拉胶的理想结构是一个1,3-链接P-D-吡喃（型）半乳糖-4-硫酸盐和1,4-链接3,6-酐-R-D-半乳糖的二糖。I-卡拉胶有一个非常类似的结构，除了在酐-半乳糖二分之一的位置2上一个额外的酯硫酸盐团的存在。这两种卡拉胶有众所周知的构建iono-凝体胶的能力而被广泛的应用于食品工业。K-卡拉胶的凝体胶形成已经成为许多研究的主题，现在一个巨大分子构造的混乱排序转换是凝胶化的先决条件以备广泛接受。然而，准确的凝胶化机制仍然是一个值得讨论的问题。从半晶质K-卡拉胶光纤的第一个X-射线衍射学暗示了卡拉胶单螺旋被并排的塞满到后来的研究假设一个缠绕的双螺旋模型，在光纤中的K-卡拉胶的线，包括基本的螺旋结构的数量是一个长期存在的论题。K-卡拉胶是一个经历了在三个基本构造转换的聚电解多聚糖：混乱的（dis）,基本排列（hel,或者一个单螺旋链或者一个同轴交互的双螺旋，依靠以选择的模型），和一个并排的二聚物（dim）的基本螺旋。二聚物表明了凝胶体接合的最初的构象元素，但它也呈现了多聚糖链结交的最初步骤。K-卡拉胶作为一种多聚电解质，这三种构型有不同的线性电荷密度的价值和对它们相关的热动力学稳定的不同的静电学的贡献。在所谓的“构象的相位图表”中后者可以被形象化，作为一个重要的物理变量的功能，也就是，温度（T）和离子浓度（I）。K-卡拉胶的构象相位图表的检查揭示了helanddim构象的（I,T）区域的存在非常密集而且大量的交迭。此外，因为他们的结构差异只是由于螺旋支链的联合，所以两种构造都具有相同的光学活动性价值。K-卡拉胶链的构象和联合的特性强烈的依靠着媒介的盐和离子浓度的种类。一些阳离子例如K+,Cs+,NH4+,和Rb+都促成螺旋构型和联合。利用核磁共振分析法已经用于研究阳离子的特殊绑定。一些阴离子，如I-和SCN-，也通过在K-卡拉胶上的特殊绑定促成和稳定螺旋构型，已用127I和14N核磁共振方法分别证明。和上述的阳离子形成对照地，-和SCN-可以在一定程度上阻止大量依靠离子浓度的螺旋联合。例如，K-卡拉胶的摩尔质量越过从0到0.15MNaI构象转变不会改变，然而，摩尔质量在大约0.2MNaI或者更大时明显的增大了。被稳定化处理了（次级）螺旋结构的僵化的卡拉胶链的这些阳离子，使在浓缩的卡拉胶溶液中获得向列相位成为可能。有趣的是，Chronakis和Ramzi也能运用单螺旋的结构参量模拟卡拉胶的向列相位的实验行为。已经尝试运用直接测量已准备在I-和SCN-溶液中排列的卡拉胶分子质量的方法决定在卡拉胶螺旋中是单链还是双链。另外，在一个卓越的模式或者用套色版连结，运用渗透压计或者光散射这样非常诡辩的方法来分析分馏和未分馏的卡拉胶，在光散射实验中，摩尔质量的增加经常归结于明确的多链排列构象的采用。然而，随后显示出这只是链的联合的结果。Bongaerts和同事们发表了一个关于这个问题的彻底研究。一系列的调查，提出了一个有趣的方法采用酸K-卡拉胶降解保持在无序并下令构象变化和突出卡拉胶在两种情况下的反应。K-卡拉胶降解率在有序的状态被发现是10倍的无序状态较慢，在糖苷键的反应差别也与降解产物的差异。这些产品已在无序构象多极模型分布，作为一个随机卵裂预期的键，而双峰分布在螺旋构象的情况下观察。虽然离子条件对应为K和I-卡拉胶大规模联合，结果被解释为支持一个K-卡拉胶双链有序构象模型。卡拉胶酶是藻类生物量在回收涉及海洋细菌发现苷水解酶。在K-,I-，九-卡拉胶酶特别催化各自基板糖苷键水解。假交替单胞，沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶已被纯化，并显示产生新型。这种酶属于糖苷水解酶家族16生长激素，并根据所得的机制，保留糖的配置。这个卡拉胶酶基因被克隆和连续过度表达，和卡拉胶酶晶体结构已被解决。假交替单胞，沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶也有助于调查卡拉胶的化学结构，更特别是，在描述的组成和卡拉胶混合分布。在酸水解的速度和糖苷键断裂机制由沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶范围应该直接与反应性和可访问糖苷联系数呈正相关。然而，相对于酸性降解的实验中，K-卡拉胶酶可以硫酸硫酸酯基的水解，因此分析没有复杂化的降解产物。因此，我们已进行了卡拉胶在各种盐条件下酶降解研究。我们的目的是比较了K-卡拉胶对酶的活性构象不同性能的影响。样本包含的片卡拉胶（图1）,K-卡拉胶合成前体的一小部分，还考察进行比较。此示例为“低凝胶卡拉胶”确定，今后将被称为K-/片卡拉胶。表现在同等条件卡拉胶和盐为酸水解酶降解，我们同样发现，以同样的速度线圈和螺旋构象没有消化，此外，我们观察了不同多极模型和双峰分布。不过，调查通过调整碘含量的一种中间状态，我们观察到的降解率和降解，并不能简单地归因于不同的产品形态分布范围。因此，我们建议碘结合是主要的参数，调节酶降解卡拉胶（也可能和酸）。如果没有完全否定了双螺旋模型，有利于我们的动力学结果为有序卡拉胶单螺旋构象。然而，对于单个螺旋构象有确凿的证据，就是光散射实验。材料与方法制备的K-卡拉胶。K-卡拉胶（Cottonii的X6913）和低胶凝K-/y-k-卡拉胶（Cottonii的X6042）由斯比凯可提供。使用前，卡拉胶是由异丙醇沉淀净化如下。卡拉胶粉（5克）在500毫升超纯冷水（滤膜净水器）。停止加热在70°C下缓慢搅拌，直至完全溶解卡拉胶。在溶液中的多糖分别由1滴加异丙醇除了大力促成下搅拌。后离心，沉淀收集和溶解在500毫升纯水再次。两次重复。卡拉胶然后溶解在500毫升时增加29.22克氯化钠。这种盐的数量相当于50倍，在卡拉胶硫酸酯盐的浓度较大的群体。隔夜搅拌后，溶液透析（6-8000截留分子量大谱/波）对超纯水，以消除在5mM的氢氧化钠存在过多的盐和单极材料，以防止样品酸化。最后，Nacarrageenan解决办法是通过一个过滤0.45微米过滤器（颇尔生命科学，Acrodisc注射器过滤器，高温滤膜）和20mM的碳酸铵保存在冷冻状态下。酶消化。为0.4%（重量/体积原液）K-卡拉胶和0.5%,k/片10mM的Tris缓冲液（2-氨基-2-（羟甲基）-1,3-丙二醇，盐酸;）pH值8.0卡拉胶准备在室温下轻轻搅拌过夜。为了确保完全溶解，溶液加热至少1小时70°C和在4°C保存。盐溶液浓度含两次最后需要准备后才能使用。碘化钠原液的制备与2mM的硫代硫酸钠，以防止氧化。卡拉胶和盐溶液等体积混合后加热10分钟分别在70C。K-卡拉胶和低胶凝K"-卡拉胶最终浓度分别为0.2和0.25%（瓦特/5）,分别在所需盐的浓度。该混合物维持在70C,30分钟前被冷却到室温（22C）。解决办法是在室温下保持至少12小时，并之前用酶培养。在k-卡拉胶（60微克毫升-1）在适当稀释盐溶液的50倍。接着，40微升稀释的酶（0.048微克毫升-1）增加了角叉菜胶溶液和孵化毫升为25°C时进行。由于K-卡拉胶酶是在碱性溶液未经灭活的多糖化学结构，12N型氢氧化钠（占10mL样品微升）被添加到中期停止酶反应中。减少生产过程中的消化酶糖量测定中希德比和戴维森呈报，改编的方法。

核磁共振。核磁共振样品进行了氘水加入50卩1的450卡拉胶过滤水中含有不同浓度的盐溶液微升准备。核磁共振光谱记录在布鲁克的DRX400光谱仪在80.05MHz经营和使用宽带5BBO的探讨。持续时间调整为0.3s和采集时间为82毫秒（32k的时间为200kHz的频谱窗口域）。2048扫描组成的实验都是在温度设定为297进行光。所有数据（谱K和32赫兹的5磅大小的处理）上执行了与布鲁克Topspin的2.0版软件的电脑，最重要的是，在半高宽为每个使用“样本决定”布鲁克命令。碘化钠溶液的平均试验线的宽度从10毫米到100mm范围内，为1762.4±9.3Hz。结果卡拉胶的降解和次序：酶促动力学和光学活性。不断电解质浓度进行试验。通过分析培养基的还原力监测在Tris浓度增加的情况下K-卡拉胶降解时间的变化。我们选择0.2%（w/v）浓度的卡拉胶，因为此时旋光以及光散射实验均能进行，另外，该试验条件与文献所述的酸水解条件相似。降解曲线的线性部分相当于初速度，最多有15-20%的降解。如图2A显示,Figure2.EffectofNalandTrisconcentrationontherateofdegradationof(A)thestandardk-and(B)low-gellingcarrageenanincubatedFigure2.EffectofNalandTrisconcentrationontherateofdegradationof(A)thestandardk-and(B)low-gellingcarrageenanincubatedwithP.carrageenovoracarrageenase.Theorderingof(C)k・and(D)low・gellingcarrageenaninNalandTriswasanalyzedbyopticalrotation.当离子浓度逐渐增加到150mMTris的过程中，初速度一直增加。对于高浓度的Tris（200-450mM）,降解速率不再变化。这与用含有15%“-卡拉胶糖的低凝胶度的k-片卡拉胶得到的曲线相似（图2B）。随着Tris浓度的增加，K和K-/》-卡拉胶的旋光度没有任何变化（图2C,D）,溶剂加热后也没有发生构象变化。卡拉胶在Tris中的情况与其化学性质相关的四甲基盐的报道非常相似。200mM浓度以下的Tris中初速度增加可被解释为K-卡拉胶酶的“盐析”效应。低离子强度下，由于静电作用蛋白质分子相互聚集，结果导致活性较弱。排阻色谱法检测低盐浓度下酶的聚合。氯化钠为100mM时，K-卡拉胶酶只有一个洗脱峰，然而氯化钠浓度为10mM时，却有三个峰（未显示）。这种“盐析”效应与所用的盐类无关：在低浓度的碘化钠及其它盐类中有相同的结果。K-卡拉胶在碘化钠水溶液的降解率有不同的模式。对于碘化钠，降解率随着碘化钠浓度的增加而增大，碘化钠浓度达到50mM时，速度达到最大。而对于Tris，浓度达到200mM时获得最大速率（如图2A）。碘化钠浓度超过50mM时，酶活性显著降低。这种快速增加与随后的降低导致曲线有有一个最高点。与先前的报道一致，我们的旋光度试验证实100mM的碘化钠能诱导完全的螺旋形成（图2C）。这与链聚合不相连（表1和参考文献9）。对于K-/p-卡拉胶，随着碘浓度的增加，我们看到有非常类似的酶抑制效应,虽然看上去并不明显因为曲线在最大速率处没有大幅度的下降。正如其名所示，K-/片卡拉胶含有片卡拉糖集团，且胶度低。如图2D所示，这种卡拉胶形成胶与其形成螺旋能力降低相关。利用K-卡拉胶的最大变化范围以及旋光度的变化范围我们得出混合大分子中只有大约60%在150mM碘化钠中是螺旋构象。很明显混合物中片成分与K-成分比较有双重不同：它们无法达到相同的构象次序，但同时，碘浓度增加的过程中，酶促降解时它们不能也会相互转化。大家应该注意到，碘化钠浓度从150增加到600mM的过程中，螺旋构象最多可增加15%，但是酶活性降低一半还多。共溶质为常数时进行试验。如图3,增加碘化钠的量同时添加Tris使得共溶质保持常数为200mM，因为此时酶有最佳的活性（这种浓度下，pH为8,Tris的离子强度为94mM）。从0mM到200mM不断增加碘化钠的浓度，同时Tris的浓度从200mM到0mM，这样能够发现所有的情况——次序转变，从缠绕到00%螺旋线圈，如图3显示的旋光度结果。碘化钠浓度达到60mM过程中，卡拉胶的降解速率与其浓度成函数关系。碘化钠浓度太高时，初始速率大大降低，

浓度为200mM时，速率最低。共溶质常数为200mM结果显示，碘化钠浓度为25mM时螺旋开始形成，当浓度达到60mM时，螺旋构象达到峰值（图3A）。有趣的是，共溶质常数为200mM实验中，诱导形成螺旋构象所需的碘化钠浓度比溶液中单纯为碘化钠时低（与图2c比较）。iodideconcentration(mM)〔iodideconcentration(mM)〔clu^o-bep匚egjonpajsm却uclljA-e_lEl:Q:(匚(匚-E/Oebepuomuonpajwrl)AUOO-eA亘一一匚-;x¥:iodideconcentration(mM)Figure3.Theorderingandthe『白t巳ofenzymaticdegrad白tionof(A)「匚白n■白geenan白nil(吕)K-/tt-carr白白nweredeterminedwithncreasingNalconcentrations,at白constant200mMcosolutesconcentration(十Tris).

Nalconcentration(mM)Figure4.Linewidthathalfheightofthe127lNMRsignalsrecordedona-andit/tf-carrageenan.TheexperimentswereconductedwithincreasingconcentrationsofNal(A)insolutionand(吕)Nalconcentration(mM)Figure4.Linewidthathalfheightofthe127lNMRsignalsrecordedona-andit/tf-carrageenan.TheexperimentswereconductedwithincreasingconcentrationsofNal(A)insolutionand(吕)atconstant200mMcosolutesconcentration(+Ths).NH)NalConcentration(mM)在k-/片卡拉胶情况下，初始速度与碘浓度曲线显示高达200mM,最高50至70毫米，一个温柔的下降。全国最大，曲线显示在0mM和120mM左右，并以同样的速度链达到最高值后在此订购。对应的最大订货在相同条件下，以约60k-卡拉胶的％，如以不同的离子强度上述实验。这意味着这种酶的强烈抑制观察K-卡拉胶作为基质不是由对K-卡拉胶酶活性碘离子的行动造成不利，也不由一对聚合物有序构象的形成。因此，必须酶抑制由于一些对卡拉胶分子，其中尽管有链构象与碘浓度呈正相关，影响连锁无障碍的属性修改。对K-卡拉胶生化指标。米氏常数（公里）沃拉卡拉胶，卡拉胶酶这项工作估计约为0.22mM，相当于约0.007%（重量/体积卡拉胶浓度）K-卡拉胶。该Km值的沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶确定约为0.28（1-4）联系或0.009%（瓦特/V）的卡拉胶浓度。尽管决心用高分子材料，应谨慎解释，因为每个键断裂后的基板的变化，它使一对酶的饱和情况的估计。因此，在0.2%（重量/体积浓度）卡拉胶，这种酶是在饱和的条件，这表明最初的速率在0mM的碘化钠观察到接近最高速度（Vmax）。此外，这种酶的抑制作用观察，例如，在60mM可能是低估了，因为可用的基板量接近饱和的条件。卡拉胶核磁共振：碘解。据报道早些时候Grasdalen和Smidsrod，卡拉胶的构象转变是与对多糖，这是直接由宽度在半高度127I核磁共振信号（Av）增加监测碘离子结合有关。在聚合物，当发生不具约束力的情况下，信号宽度狭窄，测量Av约1800赫兹为（见材料与方法）。在100mM的碘化钠在水中，当螺旋形成，Av达到了5400赫兹，而当时与碘越来越多（图4a），最大值下降。讨论卡拉胶与碘结合构象。这项工作的新颖性实验在于,由核磁共振和降解率的研究碘阴离子效应关系。核磁共振结果的127I在图4A介绍，乙完全同意这些报告由Grasdalen和Smidsrod，随后由诺顿等人确认。虽然在与K-卡拉胶（尽管数量非常不同）卤素阴离子相互作用的一般性提示诺顿和合作workers52来解决它作为一个互动，融合所有其他作者在使用“网”具有约束力的，它不排除阴离子特异性。下面这行，我们解释，作为对平均线宽典型127I配置两个群体感知两个原子核，非常不同，物理化学的情况下，深深地影响他们放松。在这种情况下接受的解释是由所谓的“两国论-全或无的”绑定模型，它假定为配体，一个“自由”和“约束”一个国家两种类型的使用。对于低于100毫米，曲线增加碘含量是乙状，并在这两种情况下，它紧跟作为光学活性数据表明订货乙状相应的发展。改变后后达到100%，这两个曲线的形状符合“经典”的束缚分子分数的增加上线列阵的网，最简单的一个符合Langmuir等温线描述约束力。在低碘浓度，在恒定的离子强度的情况下，碘约束金额比在同等情况下较大的碘水，完全平行排列的构象更高的分数。作者：图3B和4B条表明，在相同条件下，无论订货量的构象和约束碘是在比标准K-卡拉胶案件K-/片卡拉胶，既减少在数据综合分析不断共溶质浓度和不同碘化钠解决方案的情况下，指着一对片组件无法提供良好的碘结合位点的同时，与已经提到的构象无法接合。

结论我们已经表明，K-卡拉胶由P.沃拉卡拉胶，K-卡拉胶酶（以及酸水解酶降解）的不利影响的锁链有序卡拉胶碘量，而不是由命令等多糖的构象。这些动力学的观察，我们（和其他前）分子质量测定相结合，帮助区分几种构象及碘结合的情况。起初，作为示意图如图8，Table1.MolecularMassof^-CarrageenanDeterminedforVariousIodideConcentrations9iodide,mMionicstrength,mMordering,%A4Wgmol-1note(A)ThisWork0200026500060200100294400avg:279700±11500(rel.std.=4.1%)120200100354000=(avg)+27%(B)Slootmaekersetal.22020—1500335125土1456540—15040—1504—100326375土30390avg:330750土23460(rel.std.=7.1%)200200100391000=(avg)+19%(C)Bongaertsetal.8,900—1500154000土13000150150100162000avg:157000±10000(rel.std.=6.4%)200200100206350土1060=(avg)+31%(D)GrasdalenandSmidsr^d2101500720000150150100610000avg:665900土55000(rel.std.=8.3%)200300100notdetermined(E)Hjerdeetal.2701100110000110110100notdeterminedavg:110000200300&100260000=(avg)+140%aTocompareourdatawithpreviousinvestigations,averagemolecularweightandstandarddeviation(STD)werecalculated.bDegradationconditionsGPC-LALLSin200mM(afterdialysis)butwithoutthermalpretreatment.8IIIIIIIVdisdis+helhelhel+dimIonicstrength(iodide)Figure8.SchematicrepresentationofthedifferentconformationalandiodidebindingsituationsencounteredwithincreasingNalconcentrations.Withoutiodide,^-carrageenanisinadisordered(d/s)conformation.Theincreasingamountofiodideinduceshelicalconformationofthepolysaccharide,associatedwithiodidebinding.Theamountofboundiodideincreaseswithanionconcentrationinthemediumandimpedestheenzymaticdegr白actionof^-carrageenan.Forhighiodideconcentrations,carrageenandimerization(dim)startstooccurandthecarrageenanincreasesinmolecularmass.目前表现在溶液中很少或根本没有碘，卡拉胶采用了障碍（DIS）的构象（图8）,它可以很容易退化。碘浓度增加诱导螺旋构象（hel;图811）,其中不抑制酶的活性，（二）结合碘阴离子，（三）具有与无序构象分子质量相同。这些属性是只兼容单螺旋构象。碘的浓度随碘化钠（图8III）和单螺旋上升约束力的比例阻碍了酶的高效结合。尽管如此，仍然保持在这个阶段，卡拉胶分子质量。最后，高浓度的碘进行顽抗，更因为卡拉胶以两个融合酶对自由多糖重复单元排列的负面影响降低。也就是说，更多的hel段被占领的，约束碘阴离子，而其他部分hel开始被解链成二聚体（图8IV）。附录：外文原文附录：外文原文1757Biomacromolecules2009,10,1757-17671757EnzymaticDegradationof/c-CarrageenaninAqueousSolutionPiNyvallCollen,1MaudLemoine,十RichardDaniellou,Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed.Tel.:+33298292324.Fax:+33298292324.E-mail:helben@sb-roscoff.ff.'UniversityPierreetMarieCurie.EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes.Jean-PaulGuegan,*

Towhomcorrespondenceshouldbeaddressed.Tel.:+33298292324.Fax:+33298292324.E-mail:helben@sb-roscoff.ff.'UniversityPierreetMarieCurie.EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes.sUniversityofTrieste.UniversitePierreetMarieCurie,ParisVI,CNRS,MarinePlantsandBiomolecules,UMR7139,Station

Biologique,BP74,F29680RoscoffCedex,France,EcoleNationaleSuperieuredeChimiedeRennes,

CNRS,UMR6226,CS50837,AvenueduGeneralLeclerc,F-35708RennesCedex7tFrance,and

DepartmentofLifeSciences,UniversityofTrieste,ViaGiorgieri1,1-34127Trieste,ItalyReceivedFebruary9,2009;RevisedManuscriptReceivedApril27,2009Enzymaticdegradationofstandard^-carrageenanandthelow-gellinghybridk-//<-carrageenanwereconductedusingrecombinantPseudoalteromonascarrageensvora/c-carrageenase.TheinitialvelocityoftheenzymewasdeterminedasafunctionofvaryingTrisorNalconcentrationsandatconstant200mMcosolutesconcentration,adjustingNalandTrisconcentrationsaccordingly・Inbothcases,weobservedstronginhibitionoftheenzymewithincreasingamountsofiodide.Thecharacterizationofthek・andcarrageenanorderingbyopticalrotationandthevisualizationofiodidebindingoncarrageenanby,27INMRrevealedthatinhibitionwasnotcausedbythedisordered—orderedtransitionofcarrageenaninNal,butbyiodidebinding.Theseresultswereconfirmedbyanalysisofthedegradationproductsbygelpermeationchromatography・Degradationofcarrageenaninthedisorderedstateledtoarapiddecreaseinmolecularmassandtheproductionofallpossibleneo・/c-carrabioseoligomers.Intheorderedconformation,thedegradationkinetics,thedecreaseofaveragemolecularweight,andthechainpopulationdistributionofdegradationproductsvariedwithiodideconcentration.Theseobservationswereinterpretedtobetheresultofincreasingamountsofboundiodideoncarrageenanhelicesthat,inturn,impedeenzymecatalysis.Basedontheseresults,weproposeasingle-helixorderedconformationstatefor^-carrageenanandrejectthepreviouslyadvocateddouble-helixmodel.IntroductionCarrageenansarelinearsulfatedgalactansextractedfrommanyspeciesofredseaweeds(Rhodophyta)andshareacommonbackboneofo-galactosewithalternatinga(1一3)and“(1—4)linkages.1,2Carrageenansareclassifiedaccordingtothenumberandthepositionofsulfateestergroupsandbythepresenceorabsenceofa3,6-anhydrobridgeonthe1,4-1inkedunit.34Forexample,theidealizedstructureofac-carrageenanisadisaccharideof1,3-linkedfi-D・galac(opyranose・4・sulfateand1,4-linked3,6-anhydro・a・D・galactose.(-Carrageenanhasaverysimilarstructure,exceptforthepresenceofanadditionalestersulfategrouponposition2oftheanhydro・galactosemoiety(Figure1).Thesetwocarrageenansarewell-knownfortheirabilitytoformiono・andthermoreversiblegelsandareextensivelyusedinthefoodindustry.57Gelformationof^-carrageenanhasbeenthesubjectofmanyinvestigationsanditisnowfullyacceptedthatadisorder—ordertransitionofthemacromolecularconformationisaprerequisiteforgelation.However,theprecisemechanismofgelationisstillamatterofdebate(see,forexample,refs8—10).FromthefirstX-raydiffractionstudyofsemicrystalline/c-carrageenanfibersthatsuggestedthatcarrageenansingleheliceswerepackedside-by-side11tosubsequentinvestigationsthatassumedanintertwineddouble-helixmodel,12,3thenumberofstrandsinvolvedthefundamentalhelicalconformationof^-carrageenaninthefiberisalong-standingissue.CarrageenanisapolyelectrolyticpolysaccharidethatundergoestransitionsbetweenthreebasicOSO3-OSO3-OH字UXoOH*1OHR1=H:p-carrageenanR1=SO3■:v-carrageenanR2=H:K-carrageenanR2=SO3-:i-carrageensnFigure1・Structureoftherepetitionmoietyofstandard^-carrageenan.Thelow-gelling/c-^-carrageenanisahybridstructuremadeofk-and//-carrabiosemoieties.Carrageenanisusuallyconvertedinto/i-carrageenanbyhotalkalinetreatment.conformations:disordered(dis),fundamentalordered(hel;eitherasinglehelixoracoaxialdoublehelix,dependingonthechosenmodel),andaside・by・sidedimer(dim)offundamentalhelices.Thedimerrepresentstheelementaryconformationalelementofthegeljunction,butitisalsopresentintheinitialstepsofassocialionofpolysaccharidechains.Ask・carrageenanisapolyelectrolyte,thethreeconformationswillhavedifferentvaluesoflinearchargedensityanddifferentelectrostaticcontributionstotheirrelativethermodynamicstabilities.Thelattercanbevisualizedintheso-called"conformationalphasediagram",asafunctionofimportantphysicalvariables,namely,temperature(T)andionicstrength(7).1415Inspectionoftheconformationalphasediagramofk-carrageenanrevealsthatthe(/,T)domainsofexistenceofthehelanddimconformationsareverycloseandlargelyoverlap.Moreover,bothconformationshavethesamevalueofopticalactivitybecausetheirstructuraldifferencesareonlyduetothelateralassociationofthehelices.Conformationalandassociationpropertiesofic-carrageenanchainsarestronglydependentonthenatureofthesaltsandtheionicstrengthofthemedium.16-20CationssuchasK+,Cs+,10.1021/bm9001766CCC:$40.75©2009AmericanChemicalSocietyPublishedonWeb05/21/20091758Biomacromolecules,Vol.10,No.7,2009NH4+,andRb+promotebothhelixformationandassociation.SpecificbindingofcationshasbeeninvestigatedusingNMRanalyses.2123Anions,suchasI~andSCN：alsofavorandstabilizehelicesthroughspecificbindingonK-carrageenan,asdemonstratedusingl27Iand,4NNMR,respectively.19,21Incontrasttotheabove-mentionedcations,I"andSCN"mayimpede,tosomeextent,massivehelixassociation,dependingontheirionicstrength.Forinstance,themolarmassofit-carrageenandoesnotchangeacrossconformationaltransitionsfrom0toabout0」5MNal;however,molarmassclearlyincreasesatabout0.2MNalandgreater.8,24Theseanions,whichrigidifycarrageenanchainsbystabilizingthe(secondary)helicalstructure,madeitpossibletoobtainanematicphaseinconcentratedcarrageenansolutions.2526Interestingly,ChronakisandRamzi25werealsoabletomodeltheexperimentalbehaviorofthenematicphaseofcarrageenanusingthestructuralparametersofthesingle-helix.Thedeterminationofwhetheroneortwostrandsareinvolvedincarrageenanheliceshasbeenattemptedbydirectmeasure・mentsofthemolecularweightoforderedcarrageenanpreparedin「orSCN-solutions.Inaddition,unfractionatedandfractionatedcarrageenanshavebeenanalyzedbyosmometryorbyhighlysophisticatedmethodsoflightscattering,inastandalonemodeorcoupledwithchromatography.8,9,1620,21,24,27-32Inlight-scatteringexperiments,anincreaseinmolarmasswasoftenattributedtotheadoptionofwell-definedmultichainorderedconformation(s).However,ithasbeensubsequentlyshownthatthisisjusttheresultofchainassociation.Bongaertsandco-workers8publishedathoroughstudyonthisissue・Forthisreason,additionalexperimentalevidenceisneededtounambiguouslydeterminethetopologyofthefundamentalorderedcarrageenanconformationandtocompletetheevidenceprovidedbymolecularweightdeterminationmethods.LJnfor・tunately,techniquesbasedoncalorimetry1433oropticalrotationproperties34,35areintrinsicallyinconclusive,becausetheyrelyonaprioriassumptionsofconformationandtheoreticalmodelsforinterpretation.Similarinconclusivestudieswerebasedonmolecularmodeling,30evenifcoupledwithsophisticatedNMRtechniques36(e.g.,NOESY,nuclearOverhausereffectspec・troscopy).Aseriesofinvestigationspresentedaninterestingapproachusingaciddegradationofk・carrageenanmaintainedindisorderedandorderedconformationsandhighlightvariationincarrageenanreactivityinbothconditions.2937*38Therateofdegradationof/c-carrageenanintheorderedstatewasfoundtobe10-foldslowerthaninthedisorderedstate.37Differencesinglycosidicbondreactivityarealsoassociatedwithdifferencesindegradationproducts.Theseproductshaveapolymodaldistributioninthedisorderedconformation,asexpectedforarandomcleavageofbonds,whileabimodaldistributionisobservedinthecaseofthehelicalconformation.AlthoughtheionicconditionscorrespondtomassivechainassociationforbothK--8*9'24andi-carrageenan,3940theresultwasinterpretedassupportingadouble-strandedorderedconformationmodelfor©carrageenan.3Carrageenasesareglycosidehydrolasesfoundinmarinebacteriainvolvedinrecyclingalgalbiomass.41Thek・,卜,andA-carragee-nasesspecificallycatalyzethehydrolysisof0(1—4)glycosidicbondsoftheirrespectivesubstrates.Pseudocilteromonascarrag-eenovoraK-carrageenasehasbeenpurified(32kDa)andshowntoyieldneo-Ac-carrabioseandneo-/c-carratetraoseasendproducts.42ThisenzymebelongstotheglycosidehydrolasefamilyGH16,likesomeagarases,andproceedsaccordingtoamechanismthatretainstheanomericconfiguration.4344ThegeneCollenetal.ofthiscarrageenasehasbeenclonedandrecombinantlyoverexpressed,andcarrageenasestructurehasbeensolvedbycrystallography.45P.carrageenovora/c-carrageenasehasalsobeeninstrumentalininvestigatingthechemicalstructureofcarrageenanand,moreespecially,indescribingthecompositionanddistributionofcarrageenanhybrids.46Intermsofacidhydrolysis,therateandmechanismofglycosidicbondcleavagebyP.carrageenovora/c-carrageenaseshouldbedirectlycorrelatedwiththereactivityandthenumberofaccessibleglycosidiclinkages・However,incontrasttoaciddegradationexperiments,the^-carrageenaseemployedisdevoidofanysulfataseactivitythatcanhydrolyzethesulfateestergroupandthuscomplicatetheanalysisofthedegradationproducts.Wehavethereforeundertakenthestudyoftheenzymaticdegradationofcarrageenaninvarioussaltconditions.Weaimedtocomparetheinfluenceofthedifferentconformationalpropertiesofk・carrageenanonenzymeactivity.A