瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤的pc-12细胞creb表达的影响

瓜子金皂苷己对鱼藤酮损伤的pc-12细胞creb表达的影响

帕金森病（parkinson’sdisease，pd）是一种常见的神经退行性疾病，其病理变化主要表现为黑质致密区域（sn）。多媒体障碍可能会导致神经退行性死亡或缺失。目前该病的发病机制尚不明确,但有研究表明,在PD中选择性多巴胺能神经元损伤与细胞凋亡密切相关。cAMP反应元件结合蛋白(cAMPresponseelementbindingprotein,CREB)作为一种重要的真核细胞内核转录调节因子,具有多种生理功能,包括调节基因的转录、细胞的发育与生存等。有研究报道,CREB在细胞调亡过程中也起重要作用。瓜子金皂苷己(polygalasaponinF,PS-F)是从远志科植物瓜子金中提取的齐墩果烷型三萜皂苷。有研究发现,PS-F对1-甲基-4-苯基吡啶(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)、β淀粉样蛋白(amyloidbetaprotein,Aβ)等神经毒性剂损伤的细胞具有较好的神经保护作用,但具体的作用机制还不明确。本研究通过鱼藤酮(rotenone)诱导PC-12细胞损伤建立PD细胞模型,探讨瓜子金皂苷己的神经保护作用及其机制,为其应用于PD的临床治疗提供理论依据。1材料和方法1.1实验材料1.1.1细胞中心传代PC-12细胞,购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心,由本实验室传代并保存。质粒:pCREB-luc,购自Strategene公司;内参质粒pRL-TK,购自Promega公司。1.1.2检测试剂和转染试剂鱼藤酮,购自sigma公司,DMEM,马血清,均购自Gibco公司;胎牛血清,购自Hyclone公司;caspase3活性检测试剂盒,购自上海碧云天生物所;单荧光素酶报告基因检测试剂盒,购自北京原平皓生物技术有限公司;转染试剂LipofectimeTM2000,购自Invitrogen公司;其他试剂为国产或进口分析纯试剂。1.1.3lardevices检测LmaxREF型化学发光酶标检测仪,MolecularDevices;IX70-142倒置显微镜,Olympu;SKANITSOFTWARE3.2酶标仪,Thermo。1.2实验方法1.2.1细胞培养细胞PC-12细胞用含5%胎牛血清、5%马血清的高糖DMEM培养基,于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵育箱中培养,每隔48h换培养液,当单层培养细胞汇合80%以后,传代培养。实验时将PC-12细胞传入培养板中,待细胞进入对数生长期进行实验。1.2.2各组细胞的形态检测PC-12细胞按5×104个·mL-1浓度接种于96孔板中,每孔100μL(约5000细胞),贴壁24h后,倒置显微镜下观察细胞的贴壁性、生长状态良好,按照空白对照组、鱼藤酮(4μmol·L-1)处理组、鱼藤酮+瓜子金皂苷己(0.1,1.0,10.0μmol·L-1)处理组更换培养基,继续培养48h后,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,并拍照记录。1.2.3caspase3活性测定Casepase3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetylAsp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide)产生黄色的pNA(pnitroaniline),从而可以通过测定吸光度来检测caspase3的活性。PC-12细胞接种于6孔板中,贴壁24h后,倒置显微镜下观察细胞的贴壁性、生长状态,按照空白对照组、鱼藤酮(4μmol·L-1)处理组、鱼藤酮(4μmol·L-1+瓜子金皂苷己(0.1,1.0,10.0μmol·L-1)处理组更换培养基,继续培养48h后,600g、4℃离心5min收集细胞。冰浴裂解细胞15min,4℃16000g离心15min,取上清液检测蛋白浓度,测定相同蛋白浓度下caspase3的活性。按照80μL检测缓冲液、10μL待测样品、10μLAc-DEVD-pNA反应体系,37℃孵育2h后,发现颜色变化比较明显,于405nm处测吸光度值(A)。1.2.4信号通路规划转录因子与启动子结合后能够促进基因的表达,根据这一原理在报告基因如荧光素酶(luciferase)前加入与某一转录因子能够特异结合的启动子,利用该报告基因的表达情况,可检测该转录因子的活性及调节其活性信号通路的变化,同时也能够检测外界刺激或某一基因表达产物对该信号通路的影响。PC-12细胞接种于24孔板中,贴壁24h后,用脂质体法将pCREB-luc报告基因质粒400ng、pRL-TK40ng在LipofectimeTM2000介导下瞬时转染PC-12细胞,8h后更换培养基,加入不同浓度(0.1,1.0,10.0μmol·L-1)的瓜子金皂苷己刺激细胞24h后裂解细胞,取裂解的上清液根据试剂盒说明书进行检测。1.3统计学分析所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计,以单因素方差分析(One-WayANOVA)进行统计学显著性分析,实验结果以均数±标准差(ue0af±s)表示,以P<0.05认为差异有显著性。2结果2.1鱼藤酮模型各组细胞凋亡细胞比较如Fig.1所示,空白组细胞饱满、呈不规则状、折光度较好,视野中死亡细胞较少。鱼藤酮模型组细胞皱缩变圆、折光率下降、视野中凋亡细胞显著增多。不同浓度PS-F作用后能明显改善鱼藤酮损伤后PC-12细胞的状态,增加细胞存活率。2.2瓜子金皂苷己对caspase3活性的影响与空白对照组比较,鱼藤酮处理后,caspase3的活性显著升高(P<0.001),而同时加入不同浓度瓜子金皂苷己后,caspase3的活性明显降低(P<0.01,P<0.001),且具有一定的浓度依赖性(Fig.2)。2.3基因转录活性瓜子金皂苷己能浓度依赖性的增强CREB介导的基因转录的活性(Fig.3),当浓度为1.00,10.00μmol·L-1差异具有显著性(P<0.01,P<0.001)。3ps-f对鱼藤酮诱导的pc-12细胞凋亡的抑制作用PD是一种以多巴胺能神经元选择性丢失引发的运动功能障碍性疾病。PC-12细胞是大鼠肾上腺髓质能分泌儿茶酚胺的嗜铬细胞瘤细胞,广泛用于神经元特别是多巴胺能神经细胞损伤及保护的作用研究。鱼藤酮是线粒体呼吸链复合物Ⅰ抑制剂,能够通过引起线粒体功能障碍,氧化应激、能量缺乏以及激活凋亡相关基因等方式导致神经元死亡,是PD细胞模型的常用的神经毒素。本研究在体外采用鱼藤酮诱导PC-12细胞损伤为模型,研究PS-F的神经保护作用,具有一定的说服力。倒置显微镜下观察细胞形态,鱼藤酮处理后,PC-12细胞皱缩变圆、折光率下降、视野中凋亡细胞增多,细胞处于损伤状态。PS-F能够浓度依赖性的改善鱼藤酮诱导的PC-12细胞损伤。Caspase是近年来发现的一组存在于胞质中的半胱氨酸蛋白水解酶,能够特异的水解天冬氨酸残基后的肽键,导致细胞凋亡。在细胞中,caspase均以无活性的酶原状态存在,caspase蛋白家族一旦被激活后便不可逆的启动细胞死亡程序。其中,caspase3作为细胞发生凋亡的重要执行蛋白之一,是PD患者与动物模型脑中黑质多巴胺能神经元凋亡的易感因子和最终效应器。在正常细胞主要以其前体procaspase3的形式存在,无酶活性,细胞凋亡后形成有活性的caspase3。本研究通过caspase3活性检测发现,PC-12细胞被鱼藤酮损伤后,细胞中caspase3的活性显著升高,而PS-F能够浓度依赖性的降低PC-12细胞中caspase3的活性,说明PS-F对鱼藤酮诱导的PC-12细胞凋亡有一定的保护作用。CREB作为一种重要的真核细胞内核转录调节因子,是调节中枢神经系统功能的关键性因子之一,在神经系统应激性损伤后提供神经保护信号。这种神经保护信号是在CREB被激活后,通过直接或间接的激活相关基因的转录,调控某些神经营养因子(神经生长因子、脑源性神经营养因子等)及蛋白分子(c-fos、Bcl-2等)的表达来抑制神经元的凋亡和促进细胞的修复和存活。目前的研究显示,BDNF/TrkB/CREB信号通路,MAPK途径、PKA途径和Ca2+/CaMK途径等多种途径能够调节CREB的活性,增加Bcl-2与Bax比值并抑制caspase3的活性进而抑制神经细胞的凋亡。本研究显示,PS-F能